王 娟,朱小東,常 瑋

(南陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061)

0 引言

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科石斛屬多年生草本植物，是一種兼具觀賞價(jià)值及養(yǎng)生保健功能的珍稀中藥材[1-2].自古以來(lái)，鐵皮石斛就有“救命仙草”的美譽(yù).野生鐵皮石斛日漸稀少，根據(jù)《中國(guó)植物紅皮書(shū)》中的分類，屬瀕危種[3].為了滿足市場(chǎng)的需求和最大限度地保護(hù)野生石斛資源，生產(chǎn)上通常采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)(Plant tissue culture)來(lái)進(jìn)行石斛種苗的快速繁殖.近年來(lái)，研究人員對(duì)石斛組培技術(shù)進(jìn)行了大量的研究，使其生產(chǎn)工藝日臻完善.例如，朱艷等比較不同的培養(yǎng)基、激素等因素對(duì)莖段分化叢生芽的影響，同時(shí)研究了香蕉汁和活性炭對(duì)試管苗生根的影響[4].何俊平等也進(jìn)行了相似的研究，最后得出鐵皮石斛生根最適宜培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+1 g/L活性炭+10%香蕉泥[5].另通過(guò)篩選培養(yǎng)基[6-9]，調(diào)整pH值[10]和添加激素[6，11-12]等措施優(yōu)化培養(yǎng)條件，使鐵皮石斛的工廠化育苗和規(guī)?；耘嗖粩嗳〉猛黄?，極大地推動(dòng)了鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[13].然而常規(guī)組培生產(chǎn)需要滅菌鍋、超凈臺(tái)等設(shè)備來(lái)保證組培苗在無(wú)菌的環(huán)境中生長(zhǎng)，前期投入較大，限制了其生產(chǎn)規(guī)模.一些研究人員提出了通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抑菌劑而不經(jīng)過(guò)高溫滅菌，同時(shí)在普通環(huán)境下進(jìn)行接種的組培方式，即開(kāi)放組培技術(shù)[14].相對(duì)于傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)而言，開(kāi)放式組培前期投入較少，對(duì)環(huán)境的要求粗放，操作簡(jiǎn)便，非常適合中小型種苗基地進(jìn)行組培生產(chǎn).

迄今為止，基于不同抑菌劑的開(kāi)放組培技術(shù)，已在多種植物中成功應(yīng)用.其中，抑菌劑的使用是開(kāi)放式組織培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟.常用的抑菌劑包括具有抗菌作用的中藥活性成分、化學(xué)農(nóng)藥、農(nóng)用抗生素、氧化劑以及由不同抗菌成分組成的復(fù)合型抑菌劑.這幾種抑菌劑已在葡萄[15]、菊花[16]、長(zhǎng)柄扁桃[17]、甘蔗[18]、半夏[19]、東北紅豆杉[20]、白菜[21]等植物中成功應(yīng)用.盡管如此，若要將開(kāi)放組培技術(shù)應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，作為技術(shù)核心的抑菌劑應(yīng)該同時(shí)具備長(zhǎng)效抑菌效果、對(duì)植物傷害小及成本低等特點(diǎn).只有同時(shí)具備上述特點(diǎn)的抑菌劑才適合基于開(kāi)放組培技術(shù)的鐵皮石斛工廠化育苗，而氧化劑、化學(xué)農(nóng)藥等對(duì)植物傷害較大；抗生素易產(chǎn)生耐藥性；中藥活性成分的生產(chǎn)成本較高.

近年來(lái)，隨著人們對(duì)開(kāi)放組培的深入研究，已經(jīng)有多種長(zhǎng)效、廣譜、高活性、對(duì)植物友好的新型植物組織培養(yǎng)專用防污染殺菌劑被研發(fā)出來(lái)，如植培靈、清菌易等.本研究擬以鐵皮石斛無(wú)菌組培苗為材料，采用開(kāi)放組培的方式，通過(guò)在鐵皮石斛增殖培養(yǎng)過(guò)程中添加不同類型的抑菌劑來(lái)比較不同抑菌劑在開(kāi)放組培中的應(yīng)用效果，從而選擇最適宜進(jìn)行開(kāi)放組培的抑菌劑.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)所用的植物材料為軟腳鐵皮石斛無(wú)菌苗，由南陽(yáng)卉農(nóng)植物組培生物科技有限公司提供.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

大量元素：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O；

微量元素：MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4·2H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O；

鐵鹽：FeSO4·7H2O、EDTA；

有機(jī)物：肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸；

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液：NAA、6-BA;

抑菌劑及其他：植培靈(上海宇涵生物科技有限公司生產(chǎn)，使用體積分?jǐn)?shù)是2.5 mL/L)、清菌易(北京康倍斯/格林善德科技有限公司生產(chǎn)，使用體積分?jǐn)?shù)是2 mL/L)和農(nóng)用鏈霉素(重慶恒豐生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，使用質(zhì)量濃度是0.3 g/L)、蔗糖、瓊脂、HCl、NaOH.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)器材

本研究涉及的器材包括：超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基母液配制

本研究所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，母液配制采用混配法，分別按照表1中所列試劑及其所需劑量進(jìn)行大量元素、微量元素及有機(jī)物母液配制(表1).

表1 MS培養(yǎng)基母液配制 單位：mg/L

鐵鹽母液配制：按表2稱量FeSO4·7H2O和EDTA，在配制時(shí)，分別在加熱狀態(tài)下將兩種試劑溶解，最終將FeSO4溶液緩慢倒入EDTA溶液中，加蒸餾水定容至1000 mL，低溫避光保存.

表2 200×鐵鹽母液配制

NAA母液的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，配制時(shí)先用少量95%的乙醇將100 mg NAA溶解，再溶于90 mL蒸餾水中，最終用蒸餾水定容至100 mL，貯藏于棕色試劑瓶中，貼好標(biāo)簽放入冰箱內(nèi)低溫保存.

6-BA母液的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，配制時(shí)先用少量濃度為1 mol/L的HCl將100 mg 6-BA溶解，再溶于90 mL蒸餾水中，最終定容至100 mL，貯藏于棕色試劑瓶中，貼好標(biāo)簽放入冰箱內(nèi)低溫保存.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究所用培養(yǎng)基為鐵皮石斛不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A)，主要成分為：MS+2.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂.在此基礎(chǔ)上分別添加不同類型的抑菌劑及抑菌劑組合，以此作為實(shí)驗(yàn)處理組，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示，每個(gè)處理接種10瓶.所有培養(yǎng)基的pH值控制在5.6～5.8.

表3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.2.3 接種及培養(yǎng)

開(kāi)放組培的標(biāo)準(zhǔn)接種步驟為：在接種工作開(kāi)始之前，先用75%的醫(yī)用酒精對(duì)接種室進(jìn)行降塵處理；噴灑均勻后打開(kāi)紫外燈或臭氧機(jī)進(jìn)行室內(nèi)消毒，同時(shí)用75%的醫(yī)用酒精擦拭簡(jiǎn)易工作臺(tái)并打開(kāi)紫外燈、關(guān)閉透明防護(hù)隔板，時(shí)間為30 min；接種人員進(jìn)入接種室前應(yīng)穿好工作服，戴帽子、口罩，并將手洗干凈；進(jìn)入接種室后將門關(guān)閉，接種期間不要隨意走動(dòng)，減少空氣流動(dòng)；關(guān)閉室內(nèi)紫外燈及簡(jiǎn)易工作紫外燈；雙手經(jīng)75%醫(yī)用酒精消毒后在簡(jiǎn)易臺(tái)內(nèi)進(jìn)行接種，接種方法與常規(guī)組培無(wú)菌操作技術(shù)相同.

為了在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬開(kāi)放組培的操作環(huán)境，本研究在接種前按照開(kāi)放組培的操作規(guī)程進(jìn)行室內(nèi)消毒，同時(shí)在使用超凈工作臺(tái)進(jìn)行接種時(shí)將風(fēng)機(jī)關(guān)閉，以此模擬簡(jiǎn)易工作臺(tái)的接種環(huán)境.消毒結(jié)束后按無(wú)菌操作步驟進(jìn)行接種操作，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種鐵皮石斛無(wú)菌苗5株，3次重復(fù).接種后放于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(環(huán)境溫度：25 ℃；濕度60%；光周期：晝夜長(zhǎng)均為12 h).

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

接種30 d后統(tǒng)計(jì)各處理及對(duì)照組培苗的生長(zhǎng)狀況、污染情況和增殖情況.

生長(zhǎng)狀況以成活率表示：成活率=(成活苗數(shù)/外植體數(shù))×100%；

污染情況以污染率表示：污染率=(污染瓶數(shù)/接種瓶數(shù))×100%；

增殖情況以增殖系數(shù)表示：增殖系數(shù)=不定芽數(shù)/外植體數(shù).

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、描述統(tǒng)計(jì)、方差分析及相關(guān)圖表的制作采用Excel 2007中進(jìn)行.

1.2.5 抑菌劑應(yīng)用潛力分析

為了對(duì)本研究使用的幾種抑菌劑的應(yīng)用潛力進(jìn)行比較，分別以成活率、污染率、增殖系數(shù)及商品價(jià)格為參數(shù)，采用加權(quán)累積法來(lái)計(jì)算不同抑菌劑的分值，并通過(guò)分值的大小來(lái)評(píng)價(jià)其應(yīng)用潛力.每個(gè)參數(shù)的權(quán)重及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表4所示.

表4 抑菌劑應(yīng)用潛力評(píng)價(jià)體系

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)狀況比較

為了比較不同抑菌劑對(duì)石斛生長(zhǎng)的影響，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各處理及對(duì)照的成活率，結(jié)果如表5所示：T1的平均成活率最高為100%，T2為70%，T3為92%，T4的平均成活率最低為22%.方差分析結(jié)果表明，T1與CK1之間差異不顯著，表明單獨(dú)添加植培靈對(duì)石斛生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯不良影響；Duncan’s新復(fù)極差法多重比較結(jié)果顯示，4個(gè)處理組兩兩之間均存在顯著差異，表明清菌易、農(nóng)用鏈霉素均對(duì)石斛的生長(zhǎng)有一定影響(表5).

表5 不同處理成活率多重比較結(jié)果

2.2 污染情況比較

為了比較不同抑菌劑的抑菌效果，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各處理及對(duì)照的污染率情況.經(jīng)計(jì)算，T1、T2、T3及CK1的3次重復(fù)均未發(fā)生污染，污染率為0.00%；CK2的污染率最高，為100.00%；T4處理3次重復(fù)的平均污染率為10.00%.多重比較結(jié)果表明，T4與T1、T2、T3及CK1之間差異不顯著(P=0.158)，而與CK2存在極顯著差異(P<0.01).

2.3 增殖情況比較

培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)各處理及對(duì)照的增殖情況，并計(jì)算相應(yīng)的增殖率，結(jié)果如表6所示：T1為2.32，T2為0.92，T3為1.96，T4為0.4.多重比較結(jié)果表明：T1與T3之間差異不顯著，但同時(shí)與CK1之間存在顯著差異，這說(shuō)明添加植培靈還會(huì)促進(jìn)不定芽增殖，同時(shí)也表明，在添加有植培靈的培養(yǎng)基中添加鏈霉素不會(huì)對(duì)不定芽的增殖產(chǎn)生不良影響.T2和T4這兩個(gè)處理與其他兩個(gè)處理及對(duì)照之間存在顯著差異，表明單獨(dú)添加清菌易會(huì)影響不定芽的增殖，而清菌易+鏈霉素的組合則會(huì)加劇這種不良影響(表6).

表6 不同處理增殖系數(shù)多重比較結(jié)果

2.4 抑菌劑應(yīng)用效果比較

根據(jù)不同處理的成活率、污染率、增殖情況及商品單價(jià)計(jì)算相應(yīng)處理的分值，并以此作為其應(yīng)用潛力的依據(jù)，例如T1的分值Score_of_T1=0.35×3+0.35×3+0.2×2.32+0.1×1=2.664.同理可得T2、T3、T4的分值分別為2.134、2.592、和1.680.由上述結(jié)果可知：當(dāng)培養(yǎng)基單獨(dú)添加0.25%的植培靈時(shí)，應(yīng)用效果最好.

3 討論

3.1 抑菌效果比較

開(kāi)放組培的關(guān)鍵是高效廣譜性抑菌劑的選擇及其適宜濃度的篩選.多菌靈[17]、大蒜素[21]、鏈霉素[22]、代森錳鋅[23]、次氯酸鈉[24]和山梨酸鉀[25]等作為植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)抑菌劑的應(yīng)用研究已有諸多報(bào)道.近年來(lái)發(fā)現(xiàn)：乙醇提取物[26]、總黃酮[27]、植物精油[28-29]和植物源抑菌劑[30]等也具有較好抗菌活性.在進(jìn)行選擇時(shí)，首先要考慮的是其抑菌效果，然后再在此基礎(chǔ)上選擇對(duì)植物傷害最小的抑菌劑.本實(shí)驗(yàn)的4個(gè)處理在抑菌效果方面(污染率分別為0.00%、0.00%、0.00%、10%)均與CK2(污染率為100.00%)具有顯著差異，因此均可作為候選抑菌劑應(yīng)用到開(kāi)放組培中.王淑杰等選用4種不同抑菌劑進(jìn)行東北紅豆杉開(kāi)放組培，證明質(zhì)量濃度為0.4 g/L的農(nóng)用鏈霉素抑菌效果最好，這與本研究的結(jié)果一致[20].

3.2 對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育影響比較

盡管很多抑菌劑的抑菌效果很顯著，但一些種類也會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響.例如，李曉燕的研究表明：菌殺保果、1229消毒劑和硫酸慶大霉素對(duì)供試植物材料均表現(xiàn)出一定的毒性，且表現(xiàn)出劑量效應(yīng)[31].Mikami等研究表明：當(dāng)鏈霉素質(zhì)量濃度為250 μg/mL時(shí)，對(duì)水稻愈傷組織的分化有明顯抑制作用[32].在本研究涉及的4組處理中，與對(duì)照(CK1)相比，植培靈(T1)對(duì)石斛組培苗的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，而在此基礎(chǔ)上添加鏈霉素后(T3)，成活率顯著下降，其平均成活率為92%，說(shuō)明鏈霉素對(duì)石斛組培苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生了影響.與對(duì)照(CK1)相比，清菌易(T2)對(duì)石斛組培苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生了極顯著影響，其平均成活率為70%.在此基礎(chǔ)上添加鏈霉素后(T4)，平均成活率最低為22%，表明清菌易與鏈霉素存在互作效應(yīng).

對(duì)增殖系數(shù)的比較也呈現(xiàn)出上述規(guī)律.與之不同的是培養(yǎng)基中添加植培靈(T1)培養(yǎng)30 d后，其增殖系數(shù)為對(duì)照(CK1)的1.78倍.由于不清楚其中的成分，其原理不得而知，推出其中可能含有一些能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、芽分化的物質(zhì).

3.3 應(yīng)用效果比較

在采用開(kāi)放組培進(jìn)行工廠化育苗時(shí)，抑菌劑的價(jià)格也是其中要考慮的一個(gè)因素.本研究涉及的三種抑菌劑中，植培靈的價(jià)格最高，為1.65元/L，分別為清菌易和鏈霉素的4.45倍和22.25倍.然而綜合考慮組培苗的成活率、增殖系數(shù)及人工成本，植培靈是性價(jià)比最高的抑菌劑，與本研究評(píng)價(jià)體系得出的結(jié)果一致.

4 結(jié)論

在本研究所采用的幾種抑菌劑中，植培靈的抑菌效果最佳，同時(shí)對(duì)鐵皮石斛的生長(zhǎng)無(wú)不良影響，且還具有促進(jìn)不定芽增殖的作用，可將其應(yīng)用到鐵皮石斛開(kāi)放組培中，體積分?jǐn)?shù)為2.5 mL/L.