郭國(guó)業(yè)，周 悅

(南陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南省艾草開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，河南 南陽(yáng) 473061)

0 引言

蒿屬(ArtemisiaLinn.)是菊科(Asteraceae)春黃菊族菊亞族的一個(gè)大屬，該屬植物在亞歐大陸集中分布.我國(guó)有187種46變種[1]，分布全國(guó).在華北、西北、西南等地多生長(zhǎng)在草場(chǎng)、荒漠、森林、戈壁以及高山草場(chǎng)，在華東、華中、華南地區(qū)的蒿屬植物多生長(zhǎng)于荒野、道路旁以及海灘與叢林.蒿屬植物的開(kāi)花期在8～9月份，常有濃郁的揮發(fā)性香氣；多為草本，少數(shù)為灌木、半灌木.有許多種類是重要或常用的藥草植物，可以當(dāng)作利尿劑、化痰劑、抗炎癥藥、止血?jiǎng)⒌脱獕核?、抗過(guò)敏藥或艾灸用藥，少數(shù)種供食用.有的植物根系粗大，耐鹽堿，莖和枝耐沙，可以作為抗御風(fēng)沙的先鋒植物或者輔助植物[2].河南蒿屬植物資源較為豐富，常見(jiàn)的有艾(Artemisiaargyi)、黃花蒿(Artemisiaannua)、青蒿(Artemisiacarvifolia)、茵陳蒿(Artemisiacapillaris)、秦嶺蒿(Artemisiaqinlingensis)、蒙古蒿(Artenmisiamongolica)、南毛蒿(Artemisiachingii)等，多分布于山地、河坡、濕地、樹(shù)下、荒野及城區(qū)綠化地帶.

DNA條形碼(DNA barcoding)于2003年首次提出[3]，多用于物種的快速識(shí)別鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究等方面.目前，DNA條形碼技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)成熟并得以廣泛應(yīng)用，是物種譜系地理學(xué)研究和資源識(shí)別的重要工具[4].與傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)相比，DNA條形碼具有更加高效、準(zhǔn)確的物種識(shí)別效率[5]，特別是在中藥資源鑒定、藥材流通體系等方面應(yīng)用廣泛[6-9].近年來(lái)，DNA條形碼序列分析廣泛應(yīng)用于植物的分類鑒定和系統(tǒng)親緣關(guān)系的分析，成為探索種質(zhì)關(guān)系的有效手段.目前，菊科中的已有多個(gè)屬種植物利用DNA條形碼基因來(lái)探究屬內(nèi)種間關(guān)系，但在蒿屬植物中的應(yīng)用研究相對(duì)較少.蒿屬植物的系統(tǒng)分類學(xué)研究主要集中在形態(tài)分類上，在分子水平上的研究很少，急需通過(guò)分子鑒定以明確蒿屬植物的分類關(guān)系.

本研究利用DNA條形碼基因，對(duì)在南陽(yáng)市白河濕地及其周邊區(qū)域分布的9個(gè)野生蒿屬植物的基因組進(jìn)行序列變異分析、遺傳距離計(jì)算、構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，旨在探究和分析蒿屬植物的種間親緣關(guān)系，以期為艾草植物的遺傳育種和開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為2020年10月，于河南南陽(yáng)市區(qū)白河濕地公園及其周邊區(qū)域所采集的野生蒿屬植物的新鮮幼嫩葉片，并制成簡(jiǎn)易標(biāo)本保存.植物標(biāo)本依據(jù)《中國(guó)植物志》進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征識(shí)別，并由中國(guó)科學(xué)院植物研究所高天剛研究員和南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院李景照教授識(shí)別鑒定，材料確定為黃花蒿(Artemisiaannua)、南毛蒿(Artemisiachingii)、野艾蒿(Artemisialavandulifolia)、蒙古蒿(Artemisiamongolica)、艾(Artemisiaargyi)，所有試驗(yàn)材料均為野生種(表1).

表1 蒿屬植物種質(zhì)資源信息

1.2 植物基因組DNA的提取

對(duì)9個(gè)蒿屬植物樣品進(jìn)行植物基因組DNA提取.分別稱取200 mg新鮮采集的植物葉片組織，液氮研磨.利用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取[10].使用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)-BIO)檢測(cè)和成像.對(duì)樣品基因組檢測(cè)質(zhì)量不佳或顯示無(wú)帶的樣本重新提取，將提取的蒿屬植物基因組DNA 保存于-20 ℃.

1.3 引物篩選

實(shí)驗(yàn)所用引物由華大基因公司(BGI)合成.利用變異速率較高且通用性強(qiáng)的19對(duì)候選 DNA 條形碼基因?qū)飳僦参顳NA進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增和篩選[11].以Tranks 2K分子 Maker為對(duì)照，利用候選條形碼基因?qū)Σ糠州飳僦参锏臉悠凡牧螪NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)和成像，成功獲得目的基因的單一克隆.最終篩選出 ITS2和psbA-trnH作為本實(shí)驗(yàn)蒿屬植物的條形碼鑒定基因(表2).

表2 ITS2、psbA-trnH引物序列

1.4 PCR擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序

通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，確定最適反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，分別見(jiàn)表3和表4.基于所確定的最適PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，利用ITS2和psbA-trnH基因?qū)λ杉?份蒿屬植物樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，利用凝膠成像系統(tǒng)成像，對(duì)單一克隆產(chǎn)物測(cè)序.

表3 PCR反應(yīng)的最佳體系

表4 PCR反應(yīng)程序

1.5 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序得到的條形碼基因序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast以驗(yàn)證獲取序列的正確和準(zhǔn)確度.利用MEGA基因分析軟件分別對(duì)trnH序列、ITS序列以及聯(lián)合基因序列進(jìn)行變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、核苷酸置換率和遺傳距離等的分析，采用 NJ 鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[12-13].

2 結(jié)果分析

2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用植物基因組試劑盒成功提取出9種蒿屬植物葉片的基因組DNA.基于ITS2和psbA-trnH基因引物均成功擴(kuò)增出所有的植物材料的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為450 bp左右的單一明亮條帶，且擴(kuò)增和測(cè)序的成功率均為100%.圖1為基于psbA-trnH和ITS2條形碼基因的蒿屬植物PCR 擴(kuò)增凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果.

圖1 基于psbA-trnH和ITS2條形碼基因的蒿屬植物PCR擴(kuò)增檢測(cè)圖

2.2 ITS2和psbA-trnH基因序列變異分析

將測(cè)得的9條ITS2序列和psbA-trnH序列進(jìn)行校正和比對(duì)分析，剪切兩端不可信序列，最終獲得ITS2序列總長(zhǎng)為445 bp，psbA-trnH基因序列大小為441 bp.基因變異分析結(jié)果顯示，ITS2基因序列具有419個(gè)保守位點(diǎn)，19個(gè)變異位點(diǎn)，11個(gè)分離位點(diǎn)；psbA-trnH基因序列具有435個(gè)保守位點(diǎn)，6個(gè)變異位點(diǎn)，6個(gè)分離位點(diǎn).

2.3 基于ITS2+psbA-trnH聯(lián)合基因的序列變異分析

基于psbA-trnH+ ITS2聯(lián)合基因的序列變異分析結(jié)果顯示(表5).聯(lián)合基因共有886個(gè)位點(diǎn)，缺失位點(diǎn)有19個(gè)，共有保守位點(diǎn)845個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)22個(gè)，可變位點(diǎn)15個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)7個(gè).聯(lián)合基因核苷酸多態(tài)性π為 0.008，顯示ITS2和psbA-trnH的聯(lián)合基因在蒿屬植物資源中具有較高的進(jìn)化速率；基于ITS2與psbA-trnH的聯(lián)合基因的Tajima’D中性檢驗(yàn)為-0.702，顯示種群基因變異偏離中性突變，在群體進(jìn)化中可能遭遇了選擇壓力.分析數(shù)據(jù)顯示，將ITS2條形碼基因與psbA-trnH基因進(jìn)行聯(lián)合數(shù)據(jù)分析表現(xiàn)出較高的序列核苷酸多樣性.

表5 psbA-trnH+ITS2聯(lián)合基因序列變異

2.4 基于ITS2+psbA-trnH聯(lián)合基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于ITS2和psbA-trnH兩個(gè)基因的聯(lián)合分析具有更高的變異，適于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)重建.圖2為基于ITS2基因和psbA-trnH兩個(gè)基因的聯(lián)合并采用NJ鄰接算法重建蒿屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).結(jié)果顯示，9個(gè)蒿屬植物重建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)形成三個(gè)明顯的進(jìn)化分支(圖2).分支Ⅰ包含艾、南毛蒿、野艾蒿和蒙古蒿，其中艾與野艾蒿同屬一個(gè)分支，野艾蒿與南毛蒿同屬一個(gè)分支，蒙古蒿與野艾蒿聚類，表明艾、野艾蒿和蒙古蒿植物具有較近的進(jìn)化親緣關(guān)系.分支Ⅱ?yàn)?個(gè)南毛蒿植物單獨(dú)聚類，南毛蒿屬于蒿屬植物腺毛蒿組的多花蒿系，顯示該組植物與艾組植物的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)化過(guò)程較為獨(dú)立.分支Ⅲ為1個(gè)艾蒿組(Sect.Abrotanum)黃花蒿系的黃花蒿植物，顯示該組植物與艾組植物在進(jìn)化關(guān)系上存在明顯的遺傳分歧.

圖2 基于 ITS2+psbA-trnH聯(lián)合基因的蒿屬植物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)注：分支前的數(shù)字為自然支持值，分支后的數(shù)字為實(shí)驗(yàn)材料編號(hào)

3 討論

DNA條形碼技術(shù)在植物學(xué)系統(tǒng)進(jìn)化研究中起著重要作用.它以 DNA 序列為檢測(cè)對(duì)象，樣本選擇不受時(shí)節(jié)和環(huán)境的限制，有效擴(kuò)大了樣本的選擇范圍[14].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的蒿屬植物具有較豐富的遺傳多樣性.依據(jù)《中國(guó)植物志》的系統(tǒng)地位劃分，艾、野艾蒿、蒙古蒿都屬于蒿屬植物中的艾組.其中，艾屬于艾組中的真艾系，蒙古蒿屬于艾組的艾系，野艾蒿屬于艾組的野艾蒿系，三種都同屬艾組，在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上能夠準(zhǔn)確聚為一個(gè)大分支，顯示三者親緣關(guān)系較近，與形態(tài)學(xué)分類地位一致.南毛蒿屬于蒿屬植物腺毛蒿組的多花蒿系，在《中國(guó)植物志》第76(2)卷中記錄了在河南南部有南毛蒿植物的分布，但在《河南植物志》(第3冊(cè))里并未給予明確報(bào)道，李春鳳等通過(guò)調(diào)查采集及整理鑒定河南菊科蒿屬植物標(biāo)本，對(duì)《河南植物志》蒿屬植物的南毛蒿進(jìn)行了增補(bǔ)修訂和形態(tài)介紹[15-17].在本研究中，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分支Ⅰ中一個(gè)南毛蒿植物與艾組植物聚類，而5號(hào)南毛蒿植物則形成單獨(dú)聚類分支Ⅱ，顯示南毛蒿植物所在的腺毛蒿組植物與艾組植物存在一定的遺傳距離，后續(xù)將結(jié)合微形態(tài)學(xué)特征鑒定、細(xì)胞染色體分析和分子系統(tǒng)學(xué)方法，綜合分析基于分子進(jìn)化樹(shù)所產(chǎn)生的兩組蒿屬植物的系統(tǒng)關(guān)系是否能夠表明在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了種間雜交和基因交流.依據(jù)中國(guó)植物志的系統(tǒng)分類地位，黃花蒿植物屬于艾蒿組的黃花蒿系，本研究的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中顯示，黃花蒿植物單獨(dú)聚類在最外分支，顯示與其他蒿屬植物間存在明顯的遺傳分歧，進(jìn)一步驗(yàn)證了黃花蒿與其他艾組植物如艾、野艾蒿和蒙古蒿的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

本研究基于ITS2、psbA-trnH條形碼基因的聯(lián)合數(shù)據(jù)分析可以有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)蒿屬植物進(jìn)化親緣關(guān)系的分析.目前，蒿屬植物部分物種的分類地位和關(guān)系依舊存在爭(zhēng)議，本研究結(jié)論可以為鑒定蒿屬植物的種間親緣關(guān)系和分類提供一定的參考依據(jù)，對(duì)于開(kāi)發(fā)蒿屬植物鑒定的DNA條形碼基因具有一定的參考意義.