劉冬梅 趙珊 周欽育 黃燕燕 南樹港

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)屬厚壁菌門(Firmicutes)，革蘭氏陽性，兼性厭氧，具有非致病性，芽孢端生，可產(chǎn)乳酸[1- 2]，其最適生長溫度為35～50 ℃，最適生長pH值為5.5～6.5，形成的芽孢具有耐高溫、耐酸和耐膽鹽等高抗逆性特點[3]。據(jù)報道，凝結(jié)芽孢桿菌通常從含有牛奶和碳水化合物的產(chǎn)品中分離出來，嗜熱性較強，可在pH 6.2、65 ℃的條件下生長，能分解糖類生成L-乳酸，還可產(chǎn)生一些熱穩(wěn)定性淀粉酶，但不能利用麥芽糖、棉子糖、甘露醇和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)氣[4]。與芽孢桿菌屬其他物種的中心或亞末端生孢子不同，凝結(jié)芽孢桿菌孢子是末端生。此外，由于不存在細胞色素-C氧化酶，它不能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[2]。

凝結(jié)芽孢桿菌是益生菌中的后起之秀，關(guān)于其益生機理的研究較少，但已有研究發(fā)現(xiàn)，其可分泌多種代謝產(chǎn)物來調(diào)節(jié)機體的生理功能，也可與其他菌群相互協(xié)同進行機體功能的調(diào)節(jié)[5]，如調(diào)節(jié)消化道菌群的平衡——凝結(jié)芽孢桿菌兼性厭氧菌，當機體攝入并進入腸道后，其生長繁殖會不斷消耗游離氧，降低腸道內(nèi)的氧化還原電勢，從而改善厭氧益生菌的生長環(huán)境，同時抑制需氧有害菌的生長[6]。此外，凝結(jié)芽孢桿菌可分泌產(chǎn)生凝結(jié)素(Lectin)抑制鏈球菌(Streptococcus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)等有害菌的生長繁殖，提高機體的抗病毒力，減少疾病的發(fā)生[7]。研究還證實，其可在一定程度上抑制病原真菌的生長并減緩麥角固醇類物質(zhì)的合成[8]。已有研究[9- 11]發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌能提高動物機體免疫力，促進生長。例如，王乙茹等[10]發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌YNAU 5517能夠在一定程度上改善熱應(yīng)激肉雞的生產(chǎn)性能；王明陽等[11]發(fā)現(xiàn)，飼喂凝結(jié)芽孢桿菌可有效促進凡納濱對蝦的生長，提高其血清非特異性免疫水平和對副溶血弧菌的抗病力。相關(guān)機理研究[12]表明，凝結(jié)芽孢桿菌可有效識別消化道內(nèi)具有免疫佐劑功能的抗原部位，并使相關(guān)淋巴組織處于緊張的免疫準備狀態(tài)，加速免疫器官及免疫系統(tǒng)的發(fā)育、T淋巴細胞和B淋巴細胞的增加、單核-巨噬細胞的吞噬和分泌、體液和細胞免疫水平的提高。

近年來，人們越來越主張健康的食品消費方式，益生菌也因其安全、益生作用明顯等優(yōu)勢而受到越來越多科研工作者的青睞。我國益生菌菌種研究起步較晚，目前我國市場上流通的益生菌菌種多為國外引進[13]。凝結(jié)芽孢桿菌能產(chǎn)生多種酶類，具有促消化吸收及提高飼養(yǎng)動物成活、生長的功能[14]，目前已有含凝結(jié)芽孢桿菌活菌的相關(guān)藥物面世，被用于治療因腸道菌群失調(diào)引起的急、慢性腹瀉，慢性便秘，腹脹和消化不良等[15]，但有關(guān)凝結(jié)芽孢桿菌潛在功能特性的研究卻鮮見報道。有鑒于此，文中對凝結(jié)芽孢桿菌的安全性及潛在功能特性進行研究，以期為進一步的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凝結(jié)芽孢桿菌13002(CGMCC NO.7431)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DMDL 9010(CGMCC NO.5172)，由華南理工大學(xué)食品質(zhì)量與安全實驗室從中國傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離篩選得到，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 12598，均購于廣東省微生物保藏中心。

注射用環(huán)磷酰胺，國藥準字H 32020857，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；左旋咪唑，國藥準字H37020819，山東仁和堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；oligo低聚果糖，量子高科(中國)生物工程有限公司生產(chǎn)；IgA檢測試劑盒、IgG檢測試劑盒、IgM檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；SIgA酶聯(lián)免疫分析試劑盒、IL- 4酶聯(lián)免疫分析試劑盒、IFN-γ酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海撫生實業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

680型多功能酶標儀，美國Bio-Rad伯樂公司生產(chǎn)；SCIENTZ- 18N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)；SIEMENS型血液分析儀，西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)；AU640型全自動生化分析儀，OLMPUS OPTICAL有限公司生產(chǎn)。

1.3 安全性評價方法

SPF級KM小鼠20只(體質(zhì)量為18～22 g)，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。根據(jù)GB 15193.3—2014《食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗》[16]中的方法并略做改動，進行凝結(jié)芽孢桿菌13002的安全性評價。采用限量法，將凝結(jié)芽孢桿菌凍干粉稀釋為108CFU/mL的淡黃色菌液，只設(shè)10.0 g/kg(以小鼠體質(zhì)量為基準計算，下同)一個劑量組。每天一次空腹灌胃，每次灌胃量為20.0 mL/kg(以小鼠體質(zhì)量為基準計算)，觀察14 d。按文獻[16]中4.3.2.4節(jié)及其附錄G所述方法評價并判斷毒性分級。

凝結(jié)芽孢桿菌凍干粉制備方法為：將凝結(jié)芽孢桿菌13002活菌菌液按3%的體積分數(shù)接種于其液體培養(yǎng)基中，于45 ℃、120 r/min下活化培養(yǎng)24 h，經(jīng)2至3次活化培養(yǎng)后，將種子液于發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，將擴大培養(yǎng)后的菌液于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌離心3次后，取菌泥，按1：3的菌泥：保護劑質(zhì)量比混勻(保護劑制備方法：10%的脫脂奶粉及10%的海藻糖溶于0.9%的生理鹽水，85 ℃下滅菌30 min)，于-40 ℃下預(yù)凍，冷凍干燥后收集凍干粉，凝結(jié)芽孢桿菌凍干粉活菌數(shù)為6.15×1010CFU/g；將其于-20 ℃下保存，備用。

1.4 模擬胃液中的耐受性評價方法

根據(jù)文獻[17]方法進行模擬胃液中的耐受性評價：按10%的接種量(體積分數(shù)，下同)將菌懸液接種至模擬胃液中(pH值分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0)，混合均勻，于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)0、1、2、3、4 h后取樣，進行平板菌落計數(shù)，同時設(shè)添加與模擬胃液等體積的蒸餾水的樣品為空白對照組。

根據(jù)文獻[17]方法進行模擬腸液中的耐受性評價：按10%的接種量將菌懸液接種至模擬腸液中，混合均勻，于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)0、2、4、6、8 h后取樣，進行平板菌落計數(shù)，同時設(shè)添加與模擬腸液等體積的蒸餾水的樣品為空白對照組。

根據(jù)文獻[17]方法進行膽鹽耐受性評價：按10%的接種量將菌懸液分別接種至含有0.00%、0.03%、0.10%、0.20%、0.30%、0.50%牛膽鹽的水溶液中，混合均勻，于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)0、1、2、3 h后取樣，進行平板菌落計數(shù)，同時設(shè)添加與牛膽鹽溶液等體積的蒸餾水的樣品為空白對照組。

無菌條件下，按10%的接種量將菌懸液接種至pH=3.0的模擬胃液中，混合均勻，于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)3 h后，用1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至8.0，再加入等體積的模擬腸液和0.3%的膽鹽溶液，于37 ℃下恒溫避光培養(yǎng)4 h后，進行平板菌落計數(shù)，同時設(shè)添加與消化液等體積的蒸餾水的樣品為空白對照組。

1.5 抑菌能力評價方法

將活化后的菌液按5%的接種量接種于其液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)48 h后，得到發(fā)酵液。將上述發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌離心3次后，重懸，得菌懸液。取部分菌懸液超聲破碎30 min，得破碎菌體懸浮液。將上述發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，取上清，得到上清液。將上述上清液用0.22 μm水系濾膜過濾除菌，得到無菌發(fā)酵液。

根據(jù)文獻[18]的方法進行抑菌能力的評價：以大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 12598為指示菌種，取無菌生理鹽水將兩株指示菌稀釋至106～107CFU/mL后，吸取0.1 mL涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基表面，將牛津杯中心對稱放置于培養(yǎng)基表面，每個牛津杯內(nèi)注射100 μL上述待測樣品液，置于4 ℃下擴散24 h后，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

取大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 12598培養(yǎng)液，于6 000 r/min下離心15 min得到菌體，用無菌生理鹽水洗滌3次，接種至凝結(jié)芽孢桿菌13002上清液，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)4 h，根據(jù)文獻[19]方法進行脫水處理后，用SEM電鏡掃描觀察并拍照。

1.6 體內(nèi)潛在功能特性評價方法

1.6.1 動物分組及處理

SPF級Balb/c雄性小鼠50只(體質(zhì)量為18～22 g)，由南方醫(yī)科大學(xué)提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機均分成5組，各組間體質(zhì)量無顯著差異，其中，免疫抑制組(CTX)、陽性對照組(LMS)、凝結(jié)芽孢桿菌組(BCS)、凝結(jié)芽孢桿菌+低聚果糖組(BCS+FOS)通過連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺(注射量50 mg/kg)建立免疫低下小鼠模型。按圖1方式對小鼠進行灌胃，連續(xù)灌胃2周，各樣品灌胃量為10.0 mL/kg。記錄小鼠每天的體質(zhì)量變化，以便調(diào)整灌胃量。具體分組及試驗過程如圖1所示。

圖1 試驗分組及過程設(shè)計

1.6.2 一般指標的觀察方法

試驗開始后觀察小鼠的食欲、毛發(fā)、大便、活動狀況及存活情況等，每天記錄小鼠的體質(zhì)量，稱量喂食量和剩余食量，計算日攝食量，并計算飼料利用率。相關(guān)計算公式如下：

日均體質(zhì)量增加量(g/d)=平均增重/試驗天數(shù)，

日均攝食量(g/d)=平均飼料消耗量/試驗天數(shù)，

飼料利用率(%)=(日均體質(zhì)量增加量/日均攝食量)×100%。

1.6.3 器官指數(shù)的測定方法

末次灌胃24 h后，稱量小鼠體質(zhì)量，處死小鼠，解剖并分離取出肝臟、脾臟和腸道等樣本，用生理鹽水漂洗后，用測量尺測量小腸的自然長度，濾紙吸干水分，稱重。相關(guān)計算公式如下：

器官指數(shù)(mg/g)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量，

小腸指數(shù)(cm/g)=小腸長度/體質(zhì)量。

1.6.4 血常規(guī)及血清生化指標的測定方法

末次灌胃后，予小鼠禁食不禁水24 h，摘除小鼠眼球取全血50 μL，通過血液分析儀對小鼠全血進行檢測。全血離心后取血清，通過全自動生化分析儀測定其各項指標，包括L-乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總蛋白、白蛋白、球蛋白。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用IBM SPSS Statistics 24.0軟件對結(jié)果進行t檢驗和單因素分析，所有測定結(jié)果均用“均值±方差”的形式表示，P<0.05表示組間有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌13002的安全性

益生菌的安全性與其預(yù)期用途相關(guān)。益生菌應(yīng)用時需具有菌活，而且，與其他食品或藥物成分不同，益生菌具有潛在的傳染性。為了確保益生菌在應(yīng)用時的活性并避免其傳染性，世界衛(wèi)生組織制定了《食品益生菌評價指南》[20]，該指南為益生菌的臨床前檢測、臨床試驗以及在體外和動物模型下的菌種鑒定、安全性評價和功效測試等提供了參數(shù)。益生菌在應(yīng)用到食品或保健品之前，其安全性評價已被列為篩選潛在益生菌的重要標準和首要步驟。表1所示為凝結(jié)芽孢桿菌13002對KM小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果。試驗期間，實驗動物的體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，在用凝結(jié)芽孢桿菌13002菌液灌胃后，沒有觀察到兩組別的小鼠有中毒和死亡跡象，且兩組別的小鼠在試驗期間活躍，皮膚和眼睛顏色沒有任何異常變化。試驗結(jié)束后，對小鼠進行解剖，肉眼未見異常。由此可知，活菌數(shù)為108CFU/mL的凝結(jié)芽孢桿菌13002菌液對雌雄性KM小鼠急性經(jīng)口毒性LD50>20.0 mL/kg，屬于安全無毒級。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌13002對KM小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗結(jié)果1)

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌13002的耐受性

研究發(fā)現(xiàn)：胃的低pH值和胃蛋白酶的抗菌作用是防止細菌進入腸道的有效屏障；進食后胃的pH值最低至1.5，最高達6.0，但一般維持在2.5～3.5；食物的狀態(tài)影響其在胃中的運輸時間，正常情況下，食物在胃里停留2～4 h，其中液體從胃里排出的速度比固體快，大約只需要20 min就可通過胃[21]。由圖2(a)可知：凝結(jié)芽孢桿菌13002在不同pH值體外模擬胃液中的存活率隨pH值的降低而降低；在pH為3.0～5.0的模擬條件下，作用3 h后，菌株的存活率均大于80%；當pH值降低至2.5或2.0時，隨作用時間的延長，菌株存活率顯著降低(P<0.05)，這與Zárate等[22]的研究結(jié)果相符，即所有試驗乳酸桿菌在pH=4.0的條件下存活良好，幾種菌株在pH=3.0時略微喪失生存力，但所有測試的菌株在pH=2.0時基本喪失生存力。吳丹陽[23]在研究中發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌T 242在pH=3.0的模擬胃液中耐受3 h后，存活率為87.49%，與文中研究結(jié)果相符。以上結(jié)果表明，文中試驗菌株可耐受pH=3.0的模擬胃液環(huán)境，且在pH=2.0的環(huán)境中存活率大于50%。

(a)對模擬胃液的耐受性

(b)對模擬腸液的耐受性

(c)對膽鹽的耐受性

(d)對模擬胃腸液的耐受性

益生菌可存活并發(fā)揮其功能的另一個屏障是小腸，小腸中含有膽鹽和胰蛋白酶等[24]。食物通過小腸的轉(zhuǎn)運時間一般為1～4 h，小腸的pH值約為8.0[21]。益生菌的膽鹽耐受性可通過測定其在膽鹽存在下的生存能力以及在不同含量膽鹽的選擇性培養(yǎng)基中的生長狀況進行判斷。研究發(fā)現(xiàn)，被推薦為供人類使用的益生菌的膽鹽耐受含量為0.15%～0.30%[25]。圖2(b)所示為模擬腸液環(huán)境下凝結(jié)芽孢桿菌13002的存活率，當作用4 h時，菌株存活率仍在95%左右，說明試驗菌株對模擬腸液具有較高的耐受性；隨著作用時間的進一步延長，存活率顯著下降，這可能是因為模擬環(huán)境中缺少微生物生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，加劇了菌株存活率的下降。

進一步探究不同膽鹽含量下凝結(jié)芽孢桿菌13002的存活率(見圖2(c))，發(fā)現(xiàn)在0.03%～0.30%的膽鹽含量范圍內(nèi)，菌株存活率均保持在84%以上，且在0.5%的膽鹽含量下，菌株仍具有較高的存活率(大于80%)，這與Piret等[26]的研究結(jié)果相符——97%的試驗菌株可耐受高含量膽鹽且所有菌株菌活均不受胰蛋白酶濃度的影響。以上結(jié)果表明，文中試驗菌株對模擬小腸環(huán)境中的胰蛋白酶和膽鹽具有較高的耐受性。

為更好地評價凝結(jié)芽孢桿菌13002對胃腸道環(huán)境的耐受性，進一步進行模擬食物在胃腸道中的消化過程，結(jié)果如圖2(d)所示。經(jīng)7.0 h的模擬胃腸道消化液作用后，凝結(jié)芽孢桿菌13002的存活率仍保持在70%以上。

綜合上述試驗結(jié)果可知，凝結(jié)芽孢桿菌13002對模擬胃液、腸液、膽鹽均具有良好的耐受性，且在模擬胃腸道消化液中可保持較高的活菌數(shù)，有益于菌株在胃腸道內(nèi)以較高的活菌數(shù)到達其作用靶點，發(fā)揮益生功效。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌13002的抑菌能力

抑菌活性是評價益生菌的重要指標之一。研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌可消耗游離氧，在促進厭氧益生菌生長的同時可以抑制需氧有害菌的生長。此外，Le Marrec等[27]發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌在代謝過程中可產(chǎn)生一種抗菌肽——凝結(jié)素。因此，文中以金黃色葡萄球菌ATCC 12598(G+)和大腸桿菌ATCC 25922(G-)為指示菌，采用牛津杯法探究試驗菌株的抑菌活性，結(jié)果如表2和圖3所示。

表2 不同處理下待測樣品的抑菌圈直徑1)

上清液對兩種指示菌的抑菌活性明顯最高，菌懸液和無菌發(fā)酵液的抑菌活性無顯著差異，菌體破碎液的抑菌活性最差。其原因可能是凝結(jié)芽孢桿菌13002在代謝過程中會產(chǎn)生并分泌一些有機酸類、肽類等抑菌物質(zhì)，而在超聲破碎、無菌處理過程中，這些抑菌物質(zhì)失活或遭到破壞，因此使得上清液的抑菌活性顯著高于無菌發(fā)酵液和菌體破碎液；上清液的抑菌活性顯著高于菌懸液，這可能是因為在試驗菌株代謝過程中所產(chǎn)生的有機酸對指示菌有一定的抑制作用；菌懸液的抑菌活性顯著高于菌體破碎液，這種差異可能主要是因為試驗菌株為兼性厭氧菌，會與環(huán)境中的指示菌競爭營養(yǎng)、氧氣等，從而降低氧化還原電勢，抑制指示菌的生長。

為進一步探究試驗菌株對指示菌的抑菌能力，采用抑菌效果最好的上清液與指示菌共培養(yǎng)，觀察其對指示菌形態(tài)的影響，結(jié)果見圖4。由圖4(a)、4(c)可知，未經(jīng)處理的對照組，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞完整無破損，形態(tài)飽滿，表面光滑；由圖4(b)、4(d)可知，試驗處理后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細胞形態(tài)明顯發(fā)生改變，嚴重皺縮，表面出現(xiàn)凹陷，甚至還有一些原生質(zhì)外漏，且對大腸桿菌的形態(tài)破壞明顯嚴重于金黃色葡萄球菌，這與前述抑菌圈直徑的測量結(jié)果一致，可能是由于革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的細胞壁結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生的差異。

(a)大腸桿菌

(b)金黃色葡萄球菌

(a)對照組，大腸桿菌

(b)試驗組，大腸桿菌

(c)對照組，金黃色葡萄球菌

(d)試驗組，金黃色葡萄球菌

綜上，凝結(jié)芽孢桿菌13002對指示菌均有一定的抑菌活性，且對指示菌株大腸桿菌(G-)的抑菌效果要優(yōu)于金黃色葡萄球菌(G+)。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌13002對小鼠體質(zhì)量的影響

CTX組、LMS組、BCS組、BCS+FOS組連續(xù)3天腹腔注射50 mg/kg環(huán)磷酰胺后，各組小鼠的體質(zhì)量均顯著降低，說明試驗建模成功。圖5所示為各組實驗小鼠的每日體質(zhì)量變化。試驗期間各組小鼠活動正常，且隨試驗時間的延長，各組小鼠的體質(zhì)量均呈持續(xù)性增加的趨勢。其中，試驗期間對照組總增重2.21 g，CTX組總增重1.03 g，LMS組總增重2.21 g，BCS組總增重1.76 g，BCS+FOS組總增重1.62 g。說明環(huán)磷酰胺可影響小鼠的正常生長；而補充治療左旋咪唑后，小鼠的體質(zhì)量增加恢復(fù)正常；補充BCS及BCS+FOS后，小鼠的生長也有所恢復(fù)，且總增重與對照組無顯著差異(P<0.05)。

圖5 各組實驗小鼠每日體質(zhì)量的變化

表3為各組實驗小鼠的攝食量及飼料利用率。各組小鼠的日均體質(zhì)量增加量在0.44～0.95 g/d之間，日均攝食量在3.72～4.49 g/d之間，飼料利用率在6.04%～8.18%之間。其中，CTX組日均體質(zhì)量增加量與其他組存在顯著差異，說明環(huán)磷酰胺建模成功，使得實驗小鼠免疫低下；而BCS、BCS+FOS組與對照組在日均體質(zhì)量增加量、日均攝食量、飼料利用率指標上均無顯著差異，綜合2.1節(jié)內(nèi)容可進一步說明，凝結(jié)芽孢桿菌13002對實驗小鼠無毒副作用；且LMS、BCS、BCS+FOS組的日均體質(zhì)量增加量、飼料利用率均顯著高于CTX組，初步說明補充治療后小鼠免疫能力得到了提高。

表3 各組實驗小鼠的攝食量及飼料利用率

2.5 凝結(jié)芽孢桿菌13002對小鼠器官指數(shù)的影響

器官指數(shù)是衡量機體器官發(fā)育和功能的重要指標。表4所示為各組實驗小鼠的器官指數(shù)。由表4可知，各組別小鼠的肝體比、肺體比、腎體比均無顯著差異，即凝結(jié)芽孢桿菌13002及低聚果糖的施用對肝、肺、腎器官無毒害作用。CTX組的脾體比顯著低于其他組，這與安松蘭等[28]的研究結(jié)果相符，脾臟是機體最大的淋巴器官，是免疫應(yīng)答的重要場所，其含有大量的巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞等多種免疫細胞，經(jīng)補充治療后，LMS、BCS、BCS+FOS組的脾體比均顯著增大，且接近對照組，初步說明BCS、BCS+FOS同LMS一樣具有一定的免疫治療作用。

器官指數(shù)可反映機體的消化吸收及發(fā)育情況。表5所示為各組實驗小鼠的腸道器官指標。由表5可知：CTX、LMS組的小腸指數(shù)顯著降低，說明小腸可能受到了損傷，影響消化吸收功能；BCS、BCS+FOS組的小腸指數(shù)顯著提高，且接近對照組，說明BCS及BCS+FOS可在一定程度上促進小腸的發(fā)育及對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

表4 各組實驗小鼠的器官指數(shù)

表5 各組實驗小鼠的腸道器官指標

2.6 凝結(jié)芽孢桿菌13002對小鼠血常規(guī)的影響

血常規(guī)檢測也稱全血細胞計數(shù)或全血細胞分析，能夠較準確地反映動物機體的健康狀況。由表6可知，各組別的淋巴細胞百分比LY、中間細胞百分比MO、中性粒細胞百分比GR、紅細胞計數(shù)RBC、血紅蛋白HGB、紅細胞壓積HCT、平均RBC血紅蛋白MCH、平均血小板體積MPV、血小板分布寬度PDW均差異顯著(P<0.05)，而其他血常規(guī)指標無顯著差異。從整體來看，補充治療BCS、BCS+FOS后可一定程度緩解注射環(huán)磷酰胺后血常規(guī)指標的變化，使各組別的指標接近對照組。

表6 各組實驗小鼠的血常規(guī)結(jié)果

2.7 凝結(jié)芽孢桿菌13002對小鼠血清生化指標的影響

表7所示為各組實驗小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、L-乳酸脫氫酶(LDH)含量。由表7可知，BCS、BCS+FOS組的ALT活性在正常范圍內(nèi)高于對照組，ALT是由肝臟釋放進入血液的，說明機體蛋白質(zhì)沉積加速，糖代謝加速，促進了生長；CTX組中該酶含量較高，研究發(fā)現(xiàn)，當組織發(fā)生病變時，該酶活力會增多。CTX組的LDH含量顯著高于其他組別，而其他組別間無顯著差異。LDH廣泛分布于機體各器官中，當組織受到損傷時，會釋放出大量的LDH，使血液中的LDH活性提高[29]。表7結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺對機體組織有一定的損傷，經(jīng)過補充治療后，這種損傷有所恢復(fù)。

表7 各組實驗小鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、L-乳酸脫氫酶含量

血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量是衡量機體蛋白質(zhì)吸收和代謝狀況的有效指標，球蛋白(GLB)的含量則與機體的體液免疫密切相關(guān)。表8所示為各組實驗小鼠血清中的蛋白含量。由表8可知：CTX組的TP含量相比對照組有所提高，但白蛋白-球蛋白比(A-G比)卻顯著降低，這可能是因為環(huán)磷酰胺使蛋白丟失過多且消耗增加；補充LMS、BCS、BCS+FOS后蛋白含量有所恢復(fù)，說明LMS、BCS、BCS+FOS可在一定程度上促進蛋白質(zhì)的消化、吸收，提高氨基酸的利用率。與對照組相比，其他組別的GLB含量顯著提高。GLB是一種存在于人體中的血清蛋白，具有免疫作用，當外來物入侵時，會刺激機體產(chǎn)生一定量的GLB，而當入侵物相對難以消滅時，會繼續(xù)刺激機體繼續(xù)產(chǎn)生更多的GLB，直到入侵物被消滅。表8結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺造模后機體均產(chǎn)生了免疫應(yīng)激作用。

表8 各組實驗小鼠血清中的蛋白含量

血清尿素氮(BUN)水平反映了機體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸代謝間的平衡狀況，當?shù)鞍踪|(zhì)合成率較高時BUN較低；血清葡萄糖(Glu)作為機體糖代謝的指標，可以反映機體內(nèi)糖代謝的情況，血清中葡萄糖含量越低，說明機體對葡萄糖利用率越高，機體內(nèi)糖代謝也就越強。表9所示為各組實驗小鼠血清中的BUN、Glu含量。由表9可知，與CTX組相比，其他組別的BUN、Glu含量顯著較低，說明補充治療對提高蛋白質(zhì)合成率及葡萄糖利用率有積極的作用。

表9 各組實驗小鼠血清中的尿素氮、葡萄糖含量

表10所示為各組實驗小鼠血清中的血脂含量，其中血清中總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)是反映機體脂類代謝功能的重要指標，血清中總膽固醇和甘油三酯含量的異常升高可能預(yù)示機體內(nèi)脂蛋白代謝異常，容易引起心、腦血管等方面的疾??；高密度脂蛋白(HDL-C)能清除組織細胞中的膽固醇，確保體內(nèi)膽固醇濃度的相對穩(wěn)定。由表10可知，BCS、BCS+FOS可降低TG、CHO、LDL-C含量，提高HDL-C含量，清除小鼠體內(nèi)多余的膽固醇，維持膽固醇的穩(wěn)定。

表10 各組實驗小鼠血清中的血脂含量

3 結(jié)論

文中對凝結(jié)芽孢桿菌13002進行了安全性及潛在功能特性的探究。首先通過小鼠急性毒理試驗，確認了凝結(jié)芽孢桿菌13002的安全性。研究發(fā)現(xiàn)，活菌數(shù)為108CFU/mL的凝結(jié)芽孢桿菌13002菌液對KM小鼠急性經(jīng)口毒性LD50>20.0 mL/kg，屬于無毒級。同時測定了試驗菌株對模擬胃腸道環(huán)境的耐受性，發(fā)現(xiàn)其對胃液、腸液、膽鹽均具有良好的耐受性，且在模擬胃腸道消化液中可保持較高的活菌數(shù)。以金黃色葡萄球菌ATCC 12598(G+)和大腸桿菌ATCC 25922(G-)為指示菌探究其抑菌活性，發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌13002對兩株指示菌均具有一定的抑菌能力，且上清液的抑菌活性最高，可明顯破壞指示菌的微觀結(jié)構(gòu)。

進一步對凝結(jié)芽孢桿菌13002(BCS)及凝結(jié)芽孢桿菌13002+低聚果糖(BCS+FOS)進行了動物實驗以探究其免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺可影響小鼠的正常生長，而補充治療左旋咪唑后，小鼠的體質(zhì)量、器官指數(shù)等增加直至恢復(fù)正常；補充BCS及BCS+FOS后，小鼠的生長也有所恢復(fù)。環(huán)磷酰胺對機體組織有一定的損傷，而經(jīng)過補充BCS、BCS+FOS后，這種損傷有所恢復(fù)，可在一定程度上恢復(fù)血常規(guī)指標，提高蛋白質(zhì)合成率及葡萄糖利用率，清除小鼠機體內(nèi)多余的膽固醇，維持膽固醇的相對穩(wěn)定，維護機體的健康，促進生長，提高免疫功能。