趙永，楊建波，林琳

1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科，烏魯木齊830000；2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

蛛網(wǎng)膜下腔出血是指腦表面或腦底部血管破裂后，血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔而引起的相應(yīng)臨床癥狀，占所有腦卒中5%～10%[1]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是指腦動(dòng)脈內(nèi)腔局限性異常擴(kuò)大引起動(dòng)脈壁上的異常膨出，為蛛網(wǎng)膜下腔出血最常見(jiàn)病因，占比約85%，具有起病急、致殘率高、病死率高等特點(diǎn)[2]。遲發(fā)性腦缺血(DCI)為動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aSAH)患者嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損和死亡的重要原因，其發(fā)生不僅涉及腦血管痙攣(CVS)，還涉及炎癥反應(yīng)[3]。微小RNA(miRNA)-210為miRNA重要成員，能通過(guò)Toll樣受體(TLR)/核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路調(diào)控炎性因子表達(dá)[4]。凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)是一種黏附因子，可通過(guò)結(jié)合氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧，降低一氧化氮利用率，啟動(dòng)血管擴(kuò)張抑制[5]。LIN等[6]研究報(bào)道，兔aSAH后基底動(dòng)脈壁上LOX-1和ox-LDL表達(dá)上調(diào)。因此我們推測(cè)LOX-1可能參與aSAH后DCI發(fā)生?？扇苄阅貥友趸偷兔芏戎鞍资荏w-1(sLOX-1)由LOX-1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白水解性裂解產(chǎn)生，能反映LOX-1表達(dá)情況。2016年1月—2020年12月,我們探討了aSAH后DCI患者血清miR-210、sLOX-1水平變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2020年12月收治的137例aSAH患者，其中男54例、女83例，年齡32～86(56.07±11.22)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～29(24.08±2.19)kg/m2；責(zé)任動(dòng)脈瘤部位：前循環(huán)111例，后循環(huán)26例；Hunt-Hess分級(jí)[7]：Ⅰ級(jí)37例，Ⅱ級(jí)50例，Ⅲ級(jí)30例，Ⅳ級(jí)17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)CT血管成像確診，符合文獻(xiàn)[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初次發(fā)病，且為單發(fā)顱內(nèi)責(zé)任動(dòng)脈瘤；③Hunt-Hess分級(jí)Ⅰ～Ⅳ級(jí)；④發(fā)病至入院治療時(shí)間<72 h；⑤年齡≥18歲；⑥臨床資料完整者；⑦患者及家屬均知情研究；排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往aSAH病史或未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤治療史者；②血液疾病、顱內(nèi)感染、腫瘤性卒中繼發(fā)的aSAH；③腦實(shí)質(zhì)出血破入蛛網(wǎng)膜下腔或外傷性aSAH者；④入院72 h內(nèi)死亡或放棄治療者；⑤深度昏迷，無(wú)自主呼吸者；⑥入院前合并嚴(yán)重感染者；⑦合并心、肝、腎等臟器功能損害者；⑧妊娠及哺乳期婦女。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018-12-023)。

1.2 基礎(chǔ)資料收集 收集患者基礎(chǔ)資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)[體質(zhì)量(kg)/身高(m)2]、吸煙史(≥1支/d，連續(xù)吸煙≥6個(gè)月)、飲酒史(≥40 g/d，≥1次/周，持續(xù)≥6個(gè)月)、病史(糖尿病、高血壓、冠心病、高血脂癥等)、責(zé)任動(dòng)脈瘤部位、動(dòng)脈瘤直徑、Hunt-Hess分級(jí)、治療方式(保守治療、開(kāi)顱夾閉、血管內(nèi)治療、開(kāi)顱夾閉+血管內(nèi)治療)。

1.3 血清miR-210、sLOX-1水平測(cè)定 采集患者入重癥監(jiān)護(hù)室時(shí)6 mL空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)，取上清，分為兩份，置于-80 ℃冰箱中待檢。其中一份采用TRIzol法提取血清總RNA(試劑購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；貨號(hào)：R1030)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，Qiagen反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海玉博生物科技有限公司；貨號(hào)：Qiagen 205111)轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入miR-210引物(正向引物：5′-CGTAGCTGTAGTCGTAGCTG-3′；反向引物：5′-GATGCTGATCGATCGTGTcG-3′)，以U6做內(nèi)參(正向引物：5′-ACGTGATGCCGTGACGATCT-3′；反向引物：5′-CGATGTCGAGCTAGTGCTAC-3′)，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后得到各管Ct，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-140-3p相對(duì)表達(dá)量。另一份用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)血清sLOX-1水平，試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司(貨號(hào)：ARB10414)。

1.4 DCI診斷和分組 DCI定義為出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損(如偏態(tài)、失語(yǔ)、偏盲等)，持續(xù)時(shí)間>1 h，或格拉斯哥預(yù)后量表(GOS)[8]惡化≥2分。且排除代謝紊亂、發(fā)燒、癲癇、腦積水、腦水腫、藥物效應(yīng)等其他原因?qū)е碌纳窠?jīng)功能缺損[9]。根據(jù)是否發(fā)生DCI分為DCI組(n=33)和非DCI組(n=104)。

2 結(jié)果

2.1 兩組基礎(chǔ)資料比較 DCI組高血壓比例、高血脂癥比例、收縮壓、Hunt-Hess分級(jí)高于非DCI組(P均<0.05)。其他指標(biāo)組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組基礎(chǔ)資料比較

2.2 兩組血清miR-210、sLOX-1水平比較 DCI組、非DCI組血清miR-210水平分別為0.63(0.55,0.68)、0.82(0.69,1.01)，sLOX-1水平分別為1 550.71(1 425.37,1 677.24)、1 123.07(837.57,1 399.36)pg/mL，兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z分別為-5.443、-5.879，P均<0.001)。

2.3 aSAH后DCI影響因素的多元Logistic回歸分析 以高血壓、高血脂癥、收縮壓、Hunt-Hess分級(jí)(≥Ⅲ級(jí)=1，<Ⅲ級(jí)=0)、miR-210、sLOX-1為自變量，是否發(fā)生DCI為因變量(不良=1，良好=0)，多元Logistic回歸分析顯示，Hunt-Hess分級(jí)≥Ⅲ級(jí)、高sLOX-1水平為aSAH后DCI獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高miR-210水平為獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 aSAH后DCI影響因素的多元Logistic回歸分析

2.4 血清miR-210、sLOX-1水平預(yù)測(cè)aSAH后DCI的價(jià)值 ROC曲線顯示，血清miR-210、sLOX-1水平預(yù)測(cè)aSAH后DCI的AUC、截?cái)嘀?、靈敏度、特異度為0.815(95%CI：0.740～0.876)、0.70、87.88%、71.15%和0.840(95%CI：0.768～0.897)、1362.70 pg/mL、87.88%、74.04%，miR-210+sLOX-1預(yù)測(cè)aSAH后DCI的AUC為0.910(95%CI：0.849～0.952)，大于miR-210、sLOX-1水平單獨(dú)預(yù)測(cè)(Z分別為3.616、2.573，P均<0.05)，靈敏度、特異度為100.00%、76.92%。

3 討論

aSAH是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的腦血管疾病，DCI為aSAH主要并發(fā)癥，研究表明，超過(guò)30%的aSAH患者在動(dòng)脈瘤破裂后3～14 d發(fā)生DCI，雖然隨著診斷模式、醫(yī)療條件、顯微外科技術(shù)的快速發(fā)展，aSAH患者預(yù)后明顯改善，但DCI仍是aSAH致殘、致死的重要原因，即使全力搶救，仍有50%的患者因此死亡，其余多數(shù)存活患者存留嚴(yán)重神經(jīng)功能損害，生活不能自理[7]。因此早期預(yù)測(cè)aSAH后DCI有助于改善aSAH患者醫(yī)療資源配置和優(yōu)化護(hù)理，改善預(yù)后。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂后，大量血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，紅細(xì)胞裂解為血紅素、血紅蛋白等物質(zhì)于出血部位沉積觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步損傷血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，誘發(fā)CVS，減少腦血流量，導(dǎo)致DCI[3]。

miRNAs是一類由19～24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈非蛋白質(zhì)編碼RNA，主要通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)的堿基互補(bǔ)結(jié)合，使靶基因mRNA翻譯抑制和降解，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、凋亡等多種重要細(xì)胞生物進(jìn)程[10]。miR-210位于人染色體11p15.5，是一種重要缺氧誘導(dǎo)基因，參與抑制細(xì)胞增殖、DNA損傷修復(fù)和促進(jìn)血管生成等細(xì)胞功能，近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-210還具有炎癥調(diào)節(jié)作用[11]。腫瘤壞死因子-α是一種涉及系統(tǒng)性炎癥的細(xì)胞因子，可激活內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞間黏附分子-1，調(diào)節(jié)受損區(qū)域組織中性粒細(xì)胞黏附，啟動(dòng)CVS，也可通過(guò)上調(diào)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，增加血管壁張力，導(dǎo)致痙攣血管腔持續(xù)狹窄[12]。ZACCAGNINI等[13]使用脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，miR-210能抑制巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子-α等促炎因子產(chǎn)生，因此我們推測(cè)miR-210可能與aSAH后DCI有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，DCI組血清miR-210水平低于非DCI組，為aSAH后DCI獨(dú)立保護(hù)因素，說(shuō)明低表達(dá)miR-210與aSAH后DCI發(fā)生有關(guān)。TLR4是模式識(shí)別受體家族成員，在大腦內(nèi)廣泛表達(dá)。研究表明，顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂后，神經(jīng)細(xì)胞表面TLR4在紅細(xì)胞裂解物刺激下能激活NF-κB通路(炎癥反應(yīng)重要信號(hào)通路)，增加腫瘤壞死因子-α、細(xì)胞間黏附分子-1等促炎因子表達(dá)，加劇aSAH大鼠腦血管和神經(jīng)損傷，單核細(xì)胞內(nèi)TLR4表達(dá)與DCI獨(dú)立相關(guān)[14]。ZACCAGNINI等[13]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-210能通過(guò)TLR4/NF-κB通路抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。MA等[14]建立aSAH后CVS大鼠模型發(fā)現(xiàn)，枕大池注射miR-20能減少基底動(dòng)脈壁厚度，增加基底動(dòng)脈管直徑，預(yù)防aSAH后CVS發(fā)生，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)大鼠基底動(dòng)脈腫瘤壞死因子-α和TLR4表達(dá)顯著下調(diào)?；谝陨涎芯?，我們認(rèn)為miR-210可能通過(guò)TLR4/NF-κB通路抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮aSAH后DCI保護(hù)作用。

LOX-1為血管內(nèi)皮細(xì)胞攝取ox-LDL主要受體，參與ox-LDL結(jié)合、內(nèi)吞、蛋白降解等過(guò)程，在炎癥反應(yīng)、缺血缺氧、高血糖水平等狀態(tài)下大量分泌。ox-LDL是動(dòng)脈硬化發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中重要參與者，LOX-1可通過(guò)結(jié)合ox-LDL，促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成，增強(qiáng)泡沫細(xì)胞吞噬脂質(zhì)能力，并能結(jié)合其相應(yīng)配體，加重局部炎性刺激，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)動(dòng)脈硬化形成[15]。目前大多研究均關(guān)注LOX-1與動(dòng)脈硬化的關(guān)系，用以診斷急性缺血性卒中、急性腦出血、缺血性心臟病等[16]。LOX-1參與血管擴(kuò)張抑制[5]，在aSAH后基底動(dòng)脈壁大量表達(dá)[6]，且與多種缺血性疾病相關(guān)，因此我們猜測(cè)LOX-1可能與aSAH患者腦血管功能障礙有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，DCI組血清sLOX-1水平低于非DCI組，分析是DCI組病情嚴(yán)重，炎癥反應(yīng)刺激內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)LOX-1有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，高血清sLOX-1水平為aSAH后DCI獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明高表達(dá)sLOX-1與aSAH后DCI發(fā)生有關(guān)。目前尚不明確LOX-1參與aSAH后DCI的相關(guān)機(jī)制，但DCI主要因動(dòng)脈內(nèi)皮功能失調(diào)和平滑肌收縮引起CVS導(dǎo)致[6]，而LOX-1參與內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。LI等[17]研究發(fā)現(xiàn)，抑制LOX-1表達(dá)可抑制活性氧/NF-κB信號(hào)通路，減輕動(dòng)脈硬化小鼠炎癥反應(yīng)。近期研究報(bào)道，高血清sLOX-1水平與aSAH患者預(yù)后不良相關(guān)[18]?；谝陨涎芯?，我們推測(cè)LOX-1可能通過(guò)損傷內(nèi)皮功能和促炎反應(yīng)參與DCI發(fā)生。ROC曲線顯示，血清miR-210、sLOX-1水平均對(duì)aSAH后DCI有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，二者聯(lián)合AUC增加，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)能提高aSAH后DCI預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，aSAH后DCI患者血清miR-210水平降低，sLOX-1水平升高，為aSAH后DCI發(fā)生獨(dú)立影響因素，聯(lián)合檢測(cè)能提高aSAH后DCI預(yù)測(cè)價(jià)值。但aSAH后DCI影響因素較多，本研究并未全部納入分析，可能存在選擇偏倚；同時(shí)關(guān)于miR-210、sLOX-1與aSAH后DCI的關(guān)系尚不明確，缺乏相關(guān)機(jī)制研究，還需多中心、大樣本研究證實(shí)。