烏蘭格日勒,包特博沁,郭念玫,邢文彥

內蒙古自治區(qū)婦幼保健院，呼和浩特 010020

七氟醚作為一種具有快速恢復特性的吸入麻醉劑，被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于住院和門診手術的全身麻醉誘導與維持，在臨床中普遍使用，并且成為妊娠期間最常用的麻醉劑之一[1]。然而，隨著人們越來越關注某些麻醉劑對發(fā)育中大腦的有害作用，在妊娠期間接觸七氟醚麻醉劑可能會影響胎兒的大腦發(fā)育[2]。在動物模型及非人類靈長類動物中的研究表明，在新生兒和妊娠期胎兒進行麻醉后，腦細胞會減少甚至喪失功能或死亡，從而導致神經認知功能受損[3]。因此，在早期大腦發(fā)育過程中使用麻醉劑可能會導致神經功能障礙和損傷。近年來對于七氟醚麻醉安全性的評估方法主要基于動物模型[4]。由于大鼠的神經發(fā)育與人類相似，故對大鼠模型的研究有助于發(fā)現新的治療方案。以往文獻表明，七氟醚引起的神經毒性可促進海馬發(fā)育的變化[5]。而妊娠早期是整個大腦皮質神經元形成的高水平階段，負責高級認知功能的海馬發(fā)育在各種神經發(fā)育過程中起重要作用[6]。本研究主要對妊娠早期大鼠進行不同持續(xù)時間的七氟醚全身麻醉處理，從而評估仔鼠海馬和頂葉皮質中干擾素誘導蛋白(AIM2)表達，同時檢測炎癥相關蛋白CD45、白細胞介素1β(IL-1β)、pro-caspase-1及caspase-1 p10水平,進一步驗證其對炎癥反應的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 選取胎齡為5～7 d的健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，體質量260～310g；所有動物購于南京樂和實驗動物技術有限公司，動物合格編號為：SCKL(Nanjing)20190018；于2020年8月—2021年3月在南京醫(yī)科大學動物實驗室完成動物實驗。實驗開始前，將所有動物圈養(yǎng)在溫度(23±2)℃、濕度(55±5)%下，光照/黑暗周期為12 h，可自由獲取食物和水。本研究動物實驗于2020年6月通過南京醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準(0000202037)。每天監(jiān)測動物健康和行為情況，包括飲食、體質量、精神狀態(tài)和病死率的評估。七氟醚購自上海熹垣生物科技有限公司(批號：XY-EP-Y0001057)；蘇木精/伊紅染色劑、尼氏染色劑、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗大鼠AIM2、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG等試劑均購自賽默飛世爾科技有限公司(中國)。麻醉氣體檢測儀購自北京康高特儀器設備有限公司(型號：FI-8000)；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司(型號：ZS-001)；光學顯微鏡購自廣州怡準化學科技有限公司(型號：BX51TF)。

1.2 動物分組 將24只妊娠早期SD大鼠按照隨機數字表法隨機分為對照組、七氟醚全身麻醉1組(S1組)和七氟醚全身麻醉2組(S2組)，每組8只。

1.3 七氟醚麻醉 將所有妊娠早期SD大鼠置于單獨的籠子中，并使用100%氧氣作為載氣進行處理，總氣體流量為4 L/min。對照組中的妊娠早期SD大鼠未進行七氟醚處理，而S1組和S2組中的妊娠早期SD大鼠用5%的七氟醚麻醉1～2 min，直至失去知覺，然后使用2%的七氟醚分別在S1組和S2組中持續(xù)麻醉2、4 h。在七氟醚麻醉期間，使用麻醉氣體檢測儀監(jiān)測麻醉室內的七氟醚、氧氣以及二氧化碳的濃度。按照規(guī)定時間停止接觸七氟醚后，將妊娠SD大鼠放回籠中直至分娩。對照組中有36只雌性仔鼠和29只雄性仔鼠。在S1組中，有35只雌性仔鼠和34只雄性仔鼠。在S2組中，有30只雌性仔鼠和35只雄性仔鼠。將仔鼠圈養(yǎng)在溫度(23±2)℃、濕度(55±5)%下，光照/黑暗周期為12 h，可自由獲取食物和水。出生后30 d，從每組中隨機選擇16只仔鼠[雌雄比例為1∶1，體質量為(110±20)g]，通過腹膜內注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉并斷頭處死，心臟驟停5 min后確認死亡，并收集腦組織。取每組8只仔鼠的腦樣本，置于4 ℃的4%多聚甲醛中固定24 h；另取每組其它8只仔鼠的腦樣本,速凍并保存在液氮中,進行蛋白質印跡法。1.4 妊娠早期七氟醚全身麻醉后仔鼠的活動速度、逃避潛伏期、穿越平臺次數檢測 采用Morris水迷宮實驗。每組隨機抽取8只仔鼠，飼養(yǎng)30 d。準備一個水溫為(22±1)℃的圓形游泳池(直徑120 cm、深度40 cm)。將一個水下站臺(直徑8 cm、高度35 cm)放置在水池的第一象限中。出生后第30天上午10點開始進行測試，并持續(xù)5 d，每天進行4次測試。將仔鼠在指定的釋放點放入水中，并放置90 s以找到平臺。在平臺上放置15 s后，將仔鼠從水池中移出，并終止實驗。如果仔鼠在90 s內未能找到平臺，則將它們手動放置在平臺上15 s。記錄仔鼠的活動速度、逃避潛伏期、穿越平臺次數，并移除平臺進行探索實驗，如既往文獻所述[7]。

1.5 妊娠早期七氟醚全身麻醉后仔鼠海馬和頂葉皮質神經元形態(tài)特征的觀察 各組腦組織進行脫水后，將腦標本固定在4%的多聚甲醛溶液中，并包埋在石蠟中。腦組織的石蠟塊包括海馬和頂葉皮質部分(切片厚度5 μm)。通常在60 ℃下用二甲苯對切片進行常規(guī)脫蠟，然后使用分級乙醇系列進行水合。在室溫下，用蘇木精對組織染色5 min，自來水沖洗。然后使用鹽酸和乙醇將組織分化30 s，在室溫下浸入自來水中15 min，然后在室溫下將其浸入伊紅染色溶液中2 min。所有樣品常規(guī)脫水并密封。對于尼氏染色，將切片在37 ℃下孵育過夜，重新水化，室溫下進行尼氏染色10 min。400倍光學顯微鏡下觀察海馬和頂葉皮層中神經元的形態(tài)。

1.6 妊娠早期七氟醚全身麻醉后仔鼠海馬和頂葉皮質神經元AIM2表達檢測 采用免疫組化法。對海馬和頂葉皮層組織(切片厚度5 μm)進行常規(guī)切片后，將標本在60 ℃下用二甲苯脫蠟，并用一系列分級的乙醇溶液水合。將切片在室溫下用3%H2O2滅活20 min，在檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中固定，并通過高溫加熱煮沸10 min，然后用5%BSA處理,室溫下放置20 min。加入兔抗大鼠AIM2(1∶200)，并將組織在4 ℃下孵育過夜。重新加熱后，將標本與辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶1 000)一起孵育。切片用3,3′-二氨基聯苯胺顯影，然后在室溫下與蘇木精染色10 min，脫水，清除并密封。400倍光學顯微鏡上觀察相關大腦區(qū)域(每個樣品隨機選擇5個視野)，并使用Aperio ImageScope 11.1軟件對細胞進行計數。

1.7 妊娠早期七氟醚全身麻醉后仔鼠海馬和頂葉皮質中CD45、IL-1β、pro-caspase-1和caspase-1 p10蛋白表達檢測 采用蛋白印跡法。將海馬和頂葉皮質的部分磨碎，并使用總蛋白提取試劑盒進行均質化。在4 ℃下以12 000×g離心10 min后，棄上清液，并使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。用5∶1的蛋白質上樣緩沖液以1∶1稀釋液通過通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)(10%凝膠)分離出總共40 μg蛋白質/泳道，95 ℃加熱5 min。然后將樣品在80 V的電壓下轉移至PVDF膜30 min，4 ℃下用含5%脫脂奶粉、0.1%Tween-20(TBST)溶液的TBS密封1 h。用含有3%BSA的TBST溶液稀釋兔抗大鼠CD45、IL-1β、pro-caspase-1、caspase-1 p10和β-actin多克隆抗體，并在4 ℃下過夜探測膜。重新加熱后，將膜與辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶1 000)在室溫下孵育1 h，然后用ECL洗滌3～5 min。將蛋白質水平標準化為β-actin蛋白水平，并使用ImageJ軟件進行灰度掃描和半定量分析。

2 結果

2.1 試妊娠早期七氟醚全身麻醉對仔鼠的活動速度、逃避潛伏期、穿越平臺次數的影響 三組仔鼠的活動速度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，如表1所示。在訓練第3～5天，三組仔鼠的逃避潛伏期總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；進一步兩兩比較發(fā)現，與對照組相比，S1組、S2組仔鼠在訓練第2～5天的逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)，而且S2組高于S1組(P<0.05)，如表2所示。三組仔鼠穿越平臺的次數差異總體比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1.278,P>0.05)，進一步兩兩比較發(fā)現，與對照組(2.13±0.64)相比，S1組(0.63±0.52)和S2組(0.25±0.46)穿越原平臺的次數減少(P<0.05)。S2組仔鼠的學習能力較差。

表1 三組仔鼠的活動速度比較

表2 三組仔鼠的逃避潛伏期比較

2.2 妊娠早期七氟醚全身麻醉對仔鼠海馬和頂葉皮質神經元形態(tài)特征的影響 蘇木精/伊紅染色、尼氏染色結果顯示，對照組仔鼠海馬和頂葉皮質神經元大小均勻、排列整齊以及輪廓清晰；與對照組相比，S1組的神經元細胞排列相對整齊，少數表現出腫脹和神經元變性；而S2組的神經元細胞無序排列，細胞體收縮并且細胞核濃縮成三角形或多邊形。尼氏染色結果表明，對照組仔鼠的海馬和頂葉皮質具有正常、清晰和完整的尼氏體；與對照組相比，S1組和S2組尼氏體呈彌散分布；而在S2組，尼氏體比S1組更彌散。

2.3 妊娠早期七氟醚全身麻醉對仔鼠海馬和頂葉皮質神經元AIM2表達的影響 見表3。

表3 三組仔鼠海馬和頂葉皮質神經元AIM2陽性表達率比較

2.4 三組仔鼠海馬和頂葉皮質中CD45、IL-1β、pro-caspase-1和caspase-1 p10蛋白表達比較 見表4。

表4 三組仔鼠海馬和頂葉皮質中炎癥相關蛋白表達比較

3 討論

七氟醚是一種廣泛應用于外科手術的麻醉藥，安全性較高[8]。然而，最近研究表明，七氟醚對中樞神經系統(tǒng)有神經毒性作用，如七氟烷導致神經干細胞的細胞周期阻滯并影響神經發(fā)育,同時七氟醚與神經元死亡的誘導有直接關系[9]。由于藥物反應、胚胎發(fā)育的劑量和時間尺度及其他混雜變量的差異，研究結論有所差異[10]。

Morris水迷宮實驗是目前評價動物學習記憶的一種經典方法。本研究結果表明，S2組仔鼠的學習能力較差，說明妊娠早期七氟醚全身麻醉對仔鼠的學習和認知功能有一定損傷，與既往文獻[11]報道較一致。本研究還通過蘇木精/伊紅染色、尼氏染色觀察發(fā)現，S1組和S2組的神經元細胞排列、形態(tài)以及尼氏體的分布出現異常，進一步說明妊娠早期七氟醚全身麻醉對仔鼠海馬和頂葉皮質的損害。

由于麻醉劑會對發(fā)育中的大腦造成嚴重損害，損害程度主要取決于麻醉劑的濃度和暴露時間[12]。因此，本研究將妊娠早期大鼠暴露于濃度為2%的七氟醚，并選擇2、4 h的七氟醚暴露時間。AIM2作為一種炎性細胞因子，在防御細菌和病毒成分中起重要作用，并且是評估腦部變化的可靠指標[13]。本研究中，與對照組比較，S1組和S2組仔鼠海馬和頂葉皮質中AIM2的表達增加，妊娠早期七氟醚全身麻醉對仔鼠海馬和頂葉皮質會產生炎性反應。本研究結果表明，S1組和S2組仔鼠海馬和頂葉皮質中CD45、IL-1β、pro-caspase-1和caspase-1 p10的蛋白相對表達量高于對照組，且S2組高于S1組。CD45是淋巴細胞的公共抗原，是一種與受體相關的蛋白酪氨酸磷酸酶，在白細胞功能中起重要作用[14]。本研究結果與既往研究一致，表明在妊娠早期中使用七氟醚麻醉可能會影響胎兒大腦的發(fā)育[15]。海馬和頂葉皮層的異常通常會導致精神障礙，如自閉癥譜系障礙和神經退行性變[16]。IL-1β是關鍵的促炎性細胞因子，對于宿主對損傷和感染的防御反應至關重要。pro-caspase-1是一種功能性酶，可通過蛋白水解方式切割其他蛋白質，如炎性細胞因子IL-1的前體，因此在細胞免疫中起炎性反應引發(fā)劑的作用。一旦被激活，pro-caspase-1通常會通過裂解而引發(fā)促炎性反應，從而激活兩種炎性細胞因子IL-1β和IL-18[17]。本研究中仔鼠海馬和頂葉皮質中CD45、IL-1β、pro-aspase-1和caspase-1 p10蛋白表達出現變化，表明妊娠早期七氟醚的暴露對胎兒大腦的不同區(qū)域有嚴重影響，包括海馬和頂葉皮質，最終可能導致后代的大腦功能和神經損傷。

綜上所述，妊娠早期七氟醚全身麻醉促進了仔鼠海馬和頂葉皮質中AIM2的表達，并進一步促進了仔鼠海馬和頂葉皮質的炎癥反應。