朱佳源，譚周進(jìn)，鄭 淘,2，肖嫩群

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院食品藥品工程系，湖南 長沙 410208)

抗生素相關(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD)是應(yīng)用抗生素后引起的腹瀉，根據(jù)是否由特定病原菌引起，可分為感染AAD和非感染性AAD，感染性AAD的常見致病菌為艱難梭菌(CD,Clostridiumdifficile)。約5%～35%患者接受抗生素治療后發(fā)生AAD[1]，且隨著抗生素的廣泛使用，AAD的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，其發(fā)病原因復(fù)雜多樣，目前認(rèn)為AAD主要是由于抗生素的使用破壞了腸道微生態(tài)平衡所致[2]。

CD又名難辨梭狀芽孢桿菌，是一種多重耐藥性厭氧的條件致病菌，隨著艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)的事件和嚴(yán)重程度顯著增加，已被公認(rèn)為全球醫(yī)院AAD的主要病原體[3]。CD可通過形成孢子引發(fā)和傳播疾病，并導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率高達(dá)30%[4-5]。在結(jié)腸中，孢子萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞，在腸道主要產(chǎn)生毒素A(TcdA) 和毒素B(TcdB) ，以及艱難梭菌轉(zhuǎn)移酶毒素等[5]。研究[6]表明，AAD與CD感染相關(guān)，大量使用抗生素會引起腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而增加腸道氨基酸水平，抑制次級膽汁酸產(chǎn)生，為CD定植創(chuàng)造條件。此外CD還可通過結(jié)合纖溶酶原(hPLG)和抑制血紅素毒性促進(jìn)腹瀉[7-8]。

AAD發(fā)病方式復(fù)雜多樣，其發(fā)病機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[5,9]。隨著高毒力菌株027和078的出現(xiàn)，以及克林霉素、頭孢菌素等抗生素的大量使用, 艱難梭菌相關(guān)腹瀉已成為全球關(guān)注的問題[10]。加拿大、美國以及一些歐洲國家多次出現(xiàn)CDI的暴發(fā)流行，給各國的醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來沉重負(fù)擔(dān)。本文通過綜述AAD與CD相關(guān)的研究進(jìn)展，旨在從CD的角度對AAD防治提供新的思路和方法，以期改進(jìn)AAD的治療與預(yù)防。

1 CD是引起AAD的主要致病菌

CD是引起AAD的主要原因，其并發(fā)癥也存在不同程度的腹瀉(見表1)[11]。AAD患者發(fā)生CDI，抑制腸道內(nèi)有益菌的生長，耐藥性CD過度增殖[3]。相比其他原因引起的腹瀉，CD致AAD有較為嚴(yán)重臨床癥狀，表現(xiàn)為結(jié)腸炎和假膜性腸炎而引起黏液、膿血便以及全身癥狀，嚴(yán)重感染可致死。因此，隨著抗生素的廣泛使用，不但要預(yù)防AAD的發(fā)生，更應(yīng)該關(guān)注由CD引起的AAD。

表1 抗生素相關(guān)CDI并發(fā)癥及其臨床特征

2 CD致AAD的作用機(jī)制

2.1 腸道菌群失調(diào) 腸道菌群在病原體防御中起著關(guān)鍵作用，其組成和功能是宿主生物學(xué)的組成成分，健康的腸道菌群對宿主是有益的，而被破壞或者失衡的腸道菌群不利于宿主健康，表現(xiàn)為易感染，患慢性炎癥、自身免疫疾病和癌癥風(fēng)險增加[6]。長期使用廣譜抗生素會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，影響腸道內(nèi)膽汁酸和氨基酸的水平，促進(jìn)CD的定植。見表2。

表2 菌群失調(diào)對CD致AAD的作用機(jī)制

2.1.1 菌群失調(diào)對CD致AAD的作用 健康的腸道微生物能建立和維持對CD的定植抗性，而AAD患者腸道菌群很大一個特點(diǎn)就是菌群失調(diào)，且腸道代謝產(chǎn)物和腸道微生物群落結(jié)構(gòu)都發(fā)生了改變，表現(xiàn)為抑制CD生長的代謝產(chǎn)物和腸道菌群多樣性減少，降低了腸道菌群對CD的定植抗性，而腸道內(nèi)氨基酸(脯氨酸：CD生長能量來源之一)增加，為CD的定植創(chuàng)造了條件[6,13]。因此菌群失調(diào)可促進(jìn)CD導(dǎo)致AAD的發(fā)生。

2.1.2 菌群失調(diào)促進(jìn)CD致AAD的方式 腸道中的某些細(xì)菌可分泌色氨酸衍生的抗生素(1-乙?；?β-咔啉和turbomycin A)，兩種抗生素均可通過抑制CD分裂時隔膜的形成，抑制CD生長繁殖，次級膽汁酸(脫氧膽酸和石膽酸)可增強(qiáng)這些抗生素的抑制活性，菌群失調(diào)引起腸道內(nèi)分泌次級膽汁酸菌群減少。因此菌群失調(diào)可以通過抑制次級膽汁酸的產(chǎn)生從而促進(jìn)CD生長[15,6]。

CD可從氨基酸分解代謝中獲得能量，在低濃度次級膽汁酸條件下，氨基酸明顯促進(jìn)CD的生長繁殖[15,10]。菌群失調(diào)引起腸道游離氨基酸(尤其是脯氨酸)含量增加，從而促進(jìn)CD生長[10]。Battaglioli 等[6]將AAD患者腸道菌群移植給無菌小鼠，小鼠感染CD后，腸道氨基酸濃度增加，且CD易感性升高,而將健康人類糞便菌群移植到小鼠腸道內(nèi)，游離脯氨酸的濃度降低，CD定植受到抑制。即菌群失調(diào)可以促進(jìn)腸道氨基酸合成，為CD定植提供能量，提示可以通過調(diào)節(jié)人體對氨基酸的攝取，改善CD引起的AAD。

2.2 CD與AAD的相互作用 CD與AAD之間存在相互作用。研究[16-17]指出，使用抗生素導(dǎo)致腸道巨噬細(xì)胞對細(xì)菌刺激反應(yīng)過度，產(chǎn)生過量的炎癥因子，同時改變腸道代謝組成，為CD創(chuàng)造有益的生長環(huán)境，且由于抗生素常見的副作用是腸道菌群失衡，腸道內(nèi)抑制CD生長的物質(zhì)和抑制色氨酸衍生的抗生素的菌群均減少，促進(jìn)CD繁殖和毒素釋放，加重AAD的癥狀。且隨著一種高毒力流行菌株BI/NAP1/027的出現(xiàn)，以及廣譜抗生素的廣泛使用，特別是克林霉素、氟喹諾酮類和頭孢菌素，AAD的發(fā)病率顯著升高。

微生物對抗生素產(chǎn)生耐藥的情況很多，近年研究發(fā)現(xiàn)，一些微生物耐藥機(jī)制受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。群體感應(yīng)是指細(xì)菌細(xì)胞間可通過互相通信聯(lián)系以協(xié)調(diào)基因的表達(dá),以群體的形式對不斷變化的環(huán)境條件作出反應(yīng)。Darkoh等[18]發(fā)現(xiàn)CD毒素的產(chǎn)生主要受新型硫代內(nèi)酯群體信號肽的控制，而這種肽獨(dú)立于tcdC基因的調(diào)控。毒素A和B受輔助基因調(diào)節(jié)劑(Agr)群體信號系統(tǒng)控制，Agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄包含agrA，-B，-C和-D的四基因操縱子，agrB1和argD1基因座負(fù)責(zé)產(chǎn)生TI信號(肽硫代內(nèi)酯AIP稱為TI信號)，TI信號是激活毒素產(chǎn)生硫代內(nèi)酯信號肽所必須的[19]。AAD患者腸道的微生物群發(fā)生改變，促進(jìn)耐藥的CD在腸道中增殖，并迅速形成細(xì)胞群后釋放TI信號，激活A(yù)grA2和AgrC2兩組分系統(tǒng)，直接或間接誘導(dǎo)毒素基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，刺激毒素產(chǎn)生[20,13]。

細(xì)菌生物被膜是附著在生物或者非生物表面并由胞外基質(zhì)所包裹的系統(tǒng)化、組織化的多細(xì)胞群落，對細(xì)菌有保護(hù)作用，能避免細(xì)菌受不利環(huán)境(如抗生素)的影響,此也是細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥的原因之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)，CD對抗生素產(chǎn)生耐藥可能是由于刺激了生物膜的形成，通過形成多層結(jié)構(gòu)化生物膜提高CD的抗微生物能力，該生物膜的形成主要是由CD固有的機(jī)制驅(qū)動，但暴露于環(huán)境中抗生素的選擇性壓力也會刺激生物膜形成，然而，梭菌生物膜如何有助于CD獲得抗藥性的具體機(jī)制尚不十分清楚[20]。因此，濫用抗生素會加重CDI，在使用抗生素治療疾病時，應(yīng)該預(yù)防CD感染。

2.3 CD與腸道菌群相互作用 CD引起的AAD抗藥性不能歸因于單一菌群作用，而是多種微生物以及與環(huán)境相互作用的結(jié)果。健康的腸道菌群能抑制CD生長，可以產(chǎn)生抑制CD的代謝產(chǎn)物，而腸道菌群失衡時促進(jìn)CD的生長，如濫用抗生素改變了腸道菌群結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為變形桿菌增加，擬桿菌和硬生菌種群減少，Porphyromonadaceae、乳桿菌和Alistipes等有益菌數(shù)量下降，大腸埃希菌和鏈球菌等有害菌增多，從而促進(jìn)CD的高水平定植。腸道菌群的代謝產(chǎn)物改變也能夠影響CD的生長繁殖和發(fā)病機(jī)制，包括影響CD孢子萌發(fā)，營養(yǎng)物質(zhì)攝取和毒素產(chǎn)生等過程[13]。由于多種菌群都表現(xiàn)出對CD的定植抗性，而有關(guān)抗生素、腸道菌群和CD之間相互作用的研究很少，因此需要進(jìn)一步的研究[21]。

2.4 CD導(dǎo)致AAD的物質(zhì)

2.4.1 細(xì)胞毒素A和細(xì)胞毒素B CD本身沒有侵襲性，主要通過分泌TcdA和TcdB致病，分別由基因tcdA 和tcdB 編碼，基因tcdC和tcdD調(diào)控，CDI患者存在tcdC部分堿基缺失和多態(tài)性，引起毒素A和毒素B的產(chǎn)生增加[21]。TcdA可以結(jié)合細(xì)菌DNA激活Toll樣受體9(TLR9)，TLR9可識別細(xì)菌DNA以促進(jìn)炎癥反應(yīng)，TcdA還可通過與腸道黏膜受體結(jié)合誘導(dǎo)固有層巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白介素-1、6、8和α腫瘤壞死因子及環(huán)氧合酶-2，導(dǎo)致上皮細(xì)胞破裂壞死和單層腸上皮細(xì)胞的緊密連接斷裂，從而導(dǎo)致腹瀉[22,17]；TcdB可以刺激單核細(xì)胞釋放炎癥因子，直接破壞腸壁細(xì)胞, 引起炎癥反應(yīng)進(jìn)而使腸黏膜細(xì)胞變性、凋亡、壞死和脫落，導(dǎo)致腹瀉[23]。醫(yī)院腹瀉患者的臨床分離株通常同時產(chǎn)生毒素A和B，但是越來越多的報告提到毒素A陰性，毒素B陽性(A-/B+)菌株能引起嚴(yán)重感染[14]。此外，毒素刺激固有免疫細(xì)胞和中毒上皮細(xì)胞生成促炎因子和趨化因子，增強(qiáng)炎癥免疫應(yīng)答，促進(jìn)CDI[5,24]。

2.4.2 hPLG hPLG是纖溶酶的前體，是哺乳動物的絲氨酸蛋白酶之一，在纖維蛋白溶解、細(xì)胞遷移和組織重塑、基底膜和細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的降解中起重要作用[7, 25]。hPLG在毒素誘導(dǎo)的腸道損傷部位表達(dá)，導(dǎo)致IL-1A、IL-1B、IL-3、IL-10、IL-12B、G-CSF、GM-CSF等細(xì)胞因子上調(diào)，促進(jìn)組織降解，此外，CD的孢子可特異性結(jié)合hPLG及活化后的纖溶酶， 纖溶酶原被招募至腸道損傷部位并與CD的孢子表面結(jié)合，在被激活為纖溶酶后切割孢子表面蛋白以促進(jìn)CD的孢子萌發(fā)，從而惡化CD誘導(dǎo)的腹瀉[7]。研究發(fā)現(xiàn)，抗纖溶酶抗體可有效抑制hPLG的激活，從而降低CDI，提示靶向纖溶酶原活化是治療CDI的潛在策略[7]。

2.4.3 血紅素 以往研究中，CDI患者胃腸腔裂解紅細(xì)胞中檢測到高濃度血紅蛋白，血紅素是血紅蛋白的含鐵原卟啉輔因子，在許多氧化還原反應(yīng)中起到酶催化的作用，包括參與呼吸過程和抗氧化應(yīng)[26,8]。血紅素對CD具有一定毒性，CD可通過HatRT外排系統(tǒng)減少毒性，但HatRT對CD定植和腸道內(nèi)維持并不起作用，表明存在另外應(yīng)對血紅素的機(jī)制[26]。研究發(fā)現(xiàn)，CD存在一個CD血紅素感應(yīng)膜蛋白(HsmRA)系統(tǒng)，能通過轉(zhuǎn)錄因子HsmR和HsmA感知血紅素，轉(zhuǎn)錄因子HsmR通過結(jié)合血紅素激活HsmA，后者可降低血紅素毒性并利用血紅素降低氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)CD在腸道內(nèi)定植并賦予其對抗菌藥物的抗性，表明靶向HsmR或HsmA的藥物開發(fā)可用于CDI治療[8]。

3 CDI引起AAD的治療

3.1 非藥物治療

3.1.1 糞便菌群移植 糞便菌群移植是指將健康人糞便菌群移入患者腸道內(nèi)，通過增加腸道定植抗性和恢復(fù)保護(hù)作用，抑制CD生長，此治療方法的優(yōu)點(diǎn)是快速、經(jīng)濟(jì)、有效，并且有助于根除CD的抗生素耐藥菌株，是治療CDI和復(fù)發(fā)性CDI(rCDI)最有效的方法，一次治愈率高達(dá)91%。而對于患腫瘤及接受造血干細(xì)胞移植的青少年兒童，推薦使用各類抗生素治療，不推薦糞菌移植[27]。菌群移植能使患者的菌群趨向于供體菌群，重新恢復(fù)腸道菌群平衡和增加短鏈脂肪酸水平[28]。糞便移植可改善CDI的治療效果，但捐獻(xiàn)者菌群轉(zhuǎn)移到接受者的同時可能導(dǎo)致其他病原體的感染和傳播[29]。

3.1.2 益生菌 益生菌作為腸道菌群的一大類別，能夠通過抑制致病菌幫助機(jī)體維持腸道平衡，還可能刺激免疫系統(tǒng)防止病原體黏附和入侵，清除腸道中的病原體和毒素[30]。鮑氏酵母菌(S.boulardii) 是一種特異性酵母來源的益生菌，可通過上調(diào)TcdA的總抗體和特異性腸道抗體 (IgA)，或通過釋放一種蛋白酶水解CD毒素預(yù)防CDI[31-32]。分析8 000多份住院期間使用抗生素的患者資料發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充鮑氏酵母菌可降低CDI的發(fā)病率，且在使用抗生素后24 h之內(nèi)補(bǔ)充效果更好[21,33]。臨床試驗(yàn)證實(shí)，特定益生菌能預(yù)防AAD和CDI復(fù)發(fā)[34]。因此使用益生菌可以預(yù)防和改善CD引起的AAD。

3.1.3 靶向CD毒素制劑 CDI由分泌型蛋白毒素介導(dǎo)，其毒力由肌醇己糖磷酸(IP6) 變構(gòu)激活其蛋白酶結(jié)構(gòu)域后的細(xì)胞內(nèi)自身蛋白水解調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，TcdB進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生構(gòu)象變化，葡糖基轉(zhuǎn)移酶及鄰近的半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時胞內(nèi)IP6作為變構(gòu)激活劑觸發(fā)毒素自身蛋白發(fā)生水解，釋放出游離的葡糖基轉(zhuǎn)移酶[35]。腸道中的高濃度鈣離子可螯合IP6，CDI小鼠口服對鈣絡(luò)合敏感性降低的IP6類似物后，進(jìn)入細(xì)胞葡糖基轉(zhuǎn)移酶減少，從而抑制了CDI引起的炎癥[35]。因此設(shè)計了一種在生理?xiàng)l件的鈣離子濃度下維持變構(gòu)活性的IP6類似物，可抑制CDI，且靶向CD毒素能避免對細(xì)菌施加選擇性壓力，從而降低發(fā)生耐藥的可能性。

3.2 藥物治療 甲硝唑或萬古霉素是治療CDI腹瀉的常用藥，患者口服甲硝唑(500 mg, 每日3次或250 mg, 每日4次)和口服萬古霉素(125 mg，每日4 次)具有相似的效果，兩種藥物對輕癥感染者的治療無差異，但對于重癥患者，萬古霉素效果更好，甲硝唑能避免院內(nèi)病例中產(chǎn)生耐萬古霉素腸球菌的風(fēng)險[36-37]。近年來，國外相繼出現(xiàn)了耐甲硝唑和萬古霉素CD的報道，且發(fā)現(xiàn)使用這兩種藥物后復(fù)發(fā)率較高，約10%～40%的患者被改善后復(fù)發(fā)CDI[38]。

中醫(yī)在中國已經(jīng)有3000多年的歷史，而且由于中藥資源豐富，成本低、副作用少等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸獲得醫(yī)學(xué)界的認(rèn)可，中西結(jié)合治療疾病在中國醫(yī)療體系中發(fā)揮著越來越重要的作用。在臨床實(shí)踐中,中藥治療AAD有很好的療效[39]。與使用安慰劑的小鼠相比，用中藥治療的CDI小鼠糞便中的毒素明顯減少[39]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥小檗堿和萬古霉素聯(lián)合治療可以協(xié)同抑制CD生長和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，且能預(yù)防萬古霉素治療引起的CDI復(fù)發(fā)[40]。體外試驗(yàn)證實(shí)，某些傳統(tǒng)中醫(yī)復(fù)方制劑可以抑制CD生長和毒素的產(chǎn)生，如在tcdA+tcdB+CD中，參苓白術(shù)散組和理中湯組對tcdA和tcdB基因的表達(dá)分別表現(xiàn)為顯著抑制和完全抑制；而對于tcdA-tcdB+CD, 兩種中藥復(fù)方制劑則完全抑制tcdB基因的表達(dá)[41]。因此，可以運(yùn)用中藥復(fù)方制劑或中西藥相結(jié)合的方式治療CD導(dǎo)致的AAD。

4 總結(jié)

研究顯示，AAD發(fā)病率在全國乃至國外呈現(xiàn)逐年上升趨勢，且隨著高毒力菌株027和078的出現(xiàn)，CD的致病性和致死率提高，CDI的風(fēng)險也顯著升高。AAD發(fā)病率的逐年增長可能與抗生素在國內(nèi)外大量使用密切相關(guān)。隨著國內(nèi)外醫(yī)院對抗生素的需求增加，抗生素濫用的現(xiàn)象屢見不鮮，應(yīng)嚴(yán)格限制抗生素的使用量，同時改善腸道菌群失衡，預(yù)防CD所致AAD的發(fā)生[42]。近年來，圍繞AAD與CDI之間的研究已成為熱點(diǎn)，研究結(jié)果也證實(shí)了AAD與CD密切相關(guān)[18]。AAD患者存在菌群失調(diào)，表現(xiàn)為產(chǎn)生抑制CD生長物質(zhì)和色氨酸衍生的抗生素菌群減少，腸道代謝產(chǎn)物次級膽汁酸的產(chǎn)生減少，而游離氨基酸含量增加，為CD的定植創(chuàng)造條件。CD主要通過分泌TcdA 和 TcdB 誘導(dǎo)AAD，也可以通過hPLG和血紅素促進(jìn)CDI導(dǎo)致AAD的發(fā)生。糞便移植可以幫助機(jī)體恢復(fù)腸道菌群平衡，口服益生菌能夠抑制CD生長，西藥治療復(fù)發(fā)率高且易產(chǎn)生耐藥性，但相關(guān)中醫(yī)藥可以有效預(yù)防CDI的復(fù)發(fā)，中藥復(fù)方制劑在抑制CD生長和其毒素產(chǎn)生方面療效也十分顯著。

綜上所述，AAD發(fā)生與CD密切相關(guān)，研究AAD與CD之間的相關(guān)性有望從CDI的角度揭示AAD的發(fā)病機(jī)制。且由于AAD的發(fā)病方式復(fù)雜多樣，CD致AAD的相關(guān)機(jī)制還有待更深入的研究。全面和深入地了解CD與AAD之間的關(guān)系，可以為臨床更合理、有效的治療和預(yù)防CD導(dǎo)致的AAD提供參考。