彭 勤，凌保東

(1. 成都醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500； 2. 成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500； 3. 南充市中心醫(yī)院藥學(xué)部，四川 南充 637000)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是醫(yī)院感染中常見的革蘭陰性條件致病菌，是全球6大超級(jí)細(xì)菌-ESKAPE(Enterococcusfaecium、Staphy-lococcusaureus、Klebsiellapneumoniae、Acinetobacterbaumannii、Pseudomonasaeruginosa、Entero-bacterspecies)的成員之一[1-2]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率不斷上升，出現(xiàn)多重耐藥、泛耐藥，甚至是全耐藥。2017年世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布首份抗生素耐藥“重點(diǎn)病原體”清單，列出了對(duì)人類健康構(gòu)成最大威脅的急需開發(fā)新抗生素的12種重點(diǎn)耐藥細(xì)菌，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌是其中之首，它的出現(xiàn)給抗感染治療帶來重重困難[3-5]。鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制主要包括藥物滅活酶的產(chǎn)生、藥物外排泵的表達(dá)、藥物作用靶點(diǎn)改變、生物被膜的形成等[6-8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在抗菌藥物等外界環(huán)境壓力下，會(huì)產(chǎn)生特異的調(diào)控性非編碼RNAs(ncRNAs)，在伴侶蛋白Hfq的作用下，與靶基因的mRNA互補(bǔ)配對(duì)或通過其構(gòu)像的變化調(diào)控相關(guān)耐藥基因(藥物外排泵、生物被膜形成、毒力因子、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞壁的合成)的表達(dá)水平，從而幫助細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境壓力[8-11]。此文針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的調(diào)控性ncRNAs對(duì)耐藥性的調(diào)控作用，以及其作為藥物靶點(diǎn)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 調(diào)控性ncRNAs的分類及作用機(jī)制

細(xì)菌調(diào)控性ncRNAs是一類廣泛存在于原核生物基因組中能被轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度為50～300nt的RNA分子。細(xì)菌ncRNAs主要位于基因間區(qū)，某些還可位于編碼基因的5’端非翻譯區(qū)(5’UTR)和3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)，能折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與靶基因的mRNA互補(bǔ)或直接與靶蛋白結(jié)合,導(dǎo)致mRNA或蛋白的功能衰減或喪失。根據(jù)調(diào)控ncRNAs的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控方式不同，本文將其分為3類即小RNAs(sRNAs)、5’UTR或3’UTR調(diào)控元件、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)[12-14]。

sRNAs多數(shù)位于基因間隔區(qū)，自身擁有獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和終止子，轉(zhuǎn)錄開始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，終止于 Rho 不依賴的轉(zhuǎn)錄終止子，以順式或反式作用調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[15-17]。靶基因的5’UTR 或者3’UTR調(diào)控元件，以順式作用調(diào)控靶基因的表達(dá)[18]，核糖體停靠機(jī)制以及核糖開關(guān)通過靶基因的5’UTR或者3’UTR的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)像改變使核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子暴露或隱藏，從而調(diào)控細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性[19-22]。CRISPR序列由眾多短而保守且含有回文序列的重復(fù)序列區(qū)(repeat，轉(zhuǎn)錄后可以形成具有穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)的tracRNA)和間隔區(qū)(spacer，被細(xì)菌俘獲的部分外源DNA序列，轉(zhuǎn)錄后可形成成熟的crRNA)組成。當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時(shí)，crRNA、tracRNA形成sgRNA復(fù)合體，與外源遺傳物質(zhì)互補(bǔ)配對(duì)并引導(dǎo)cas剪切蛋白破壞外源遺傳物質(zhì)[23-24]。ncRNAs不需要翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，作用速度比蛋白產(chǎn)生速度快，能更快地調(diào)節(jié)諸如群體感應(yīng)、生物被膜、毒力因子、藥物外排泵等相關(guān)耐藥基因的表達(dá)[25]，是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的重要參與者，因此調(diào)控性ncRNAs有希望成為對(duì)抗細(xì)菌耐藥的新靶點(diǎn)。

2 調(diào)控性ncRNAs對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及毒力的調(diào)控作用

2.1 調(diào)控性sRNAs對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成和黏附能力的調(diào)控作用 生物被膜是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物高度耐藥的重要原因，也是其重要的毒力因子，而調(diào)控性sRNAs可以通過調(diào)控細(xì)菌生物被膜的形成從而影響細(xì)菌耐藥性和毒力。付竹青[26]研究發(fā)現(xiàn)，在鮑曼不動(dòng)桿菌17978中AbsR25和AbsR28的缺失不僅能抑制其對(duì)細(xì)胞的黏附，還能顯著減少細(xì)菌生物被膜的形成以及提高大蠟螟的存活率。研究者發(fā)現(xiàn)，在鮑曼不動(dòng)桿菌17978中有9個(gè)sRNAs只在生物被膜狀態(tài)下高表達(dá)，而其中sRNA13573的高表達(dá)又可增強(qiáng)鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成的能力和對(duì)人肺上皮細(xì)胞A549的黏附能力[27]。在鮑曼不動(dòng)桿菌中，sRNAs作用于靶基因時(shí)，常需要分子伴侶Hfq的協(xié)助，以加快sRNAs與靶mRNA二聚體的形成，Kuo等[28]證明，鮑曼不動(dòng)桿菌17978在Hfq缺失的情況下生物被膜形成量減少，對(duì)細(xì)胞的黏附能力也減弱，而且參與生物被膜形成的相關(guān)基因，如外膜蛋白o(hù)mpA、菌毛合成系統(tǒng)csuA/B基因的表達(dá)水平也顯著下調(diào)。

2.2 調(diào)控性sRNAs和5’UTR調(diào)控元件對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵的調(diào)控作用 鮑曼不動(dòng)桿菌中的藥物外排泵種類多而且底物廣，其高表達(dá)是細(xì)菌耐藥重要機(jī)制之一。研究[29]發(fā)現(xiàn)，AbsR25的靶基因是外排泵主要易化家族(MFS)中的一種新型的磷霉素外排泵基因abaF，在不同亞抑菌濃度的磷霉素條件下AbsR25負(fù)調(diào)控abaF基因的表達(dá)。在雙組份調(diào)控體adeRS與adeABC外排泵操縱子中，adeR與adeA基因之間存在基因間區(qū)，而且Marchand等[30]研究顯示，adeR與adeA基因間區(qū)存在adeA 5’UTR元件。Wen等[31]研究證實(shí)，AdeR蛋白與該基因間區(qū)中的一對(duì)10 bp直接重復(fù)序列結(jié)合，從而調(diào)控adeABC的表達(dá)，提示adeR 5’UTR元件在調(diào)節(jié)adeABC的表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。

2.3 5’UTR調(diào)控元件對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥酶的調(diào)控作用 在氯霉素的誘導(dǎo)下，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶cat基因mRNA的5’UTR調(diào)控元件通過核糖體停靠機(jī)制使其二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子暴露，使下游cat基因高表達(dá)，從而使細(xì)菌對(duì)氯霉素產(chǎn)生抗性。aac/aad氨基糖苷類抗生素核糖開關(guān)在氨基糖苷類抗生素的誘導(dǎo)下，aac/aad基因mRNA的5’UTR調(diào)控元件的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子暴露，使下游aac/aad基因高表達(dá)，介導(dǎo)氨基糖苷類抗生素核糖耐藥[21-22]。

2.5 CRISPR抵抗外源耐藥基因?qū)︴U曼不動(dòng)桿菌的入侵 CRISPR的間隔序列包含了部分耐藥基因序列，可作為防御外源核酸侵襲的特定“武器”[34]。付恒霞等[35]研究62株臨床耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，無CRISPR系統(tǒng)的菌株中β-內(nèi)酰胺酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶及16sRNA 甲基化酶等耐藥基因的攜帶率均高于有CRISPR系統(tǒng)菌株，表明CRISPR一定程度上可以抵御外源耐藥對(duì)細(xì)菌的入侵。

3 靶向調(diào)控性ncRNAs的抗感染策略

3.1 Hfq靶點(diǎn) 在調(diào)控性sRNAs參與的細(xì)菌耐藥網(wǎng)絡(luò)中，Hfq發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Hfq與sRNA結(jié)合后可避免sRNA被核糖核酸酶降解，有助于sRNA的穩(wěn)定，同時(shí)促進(jìn)sRNA-mRNA結(jié)合生成環(huán)狀蛋白質(zhì)復(fù)合物[36-37]。此外，Hfq作為鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)外界環(huán)境壓力的相關(guān)應(yīng)答物質(zhì)，對(duì)幫助細(xì)菌在外界環(huán)境壓力下生長(zhǎng)繁殖具有重要意義[28, 38]。El-Mowafi等[39]發(fā)現(xiàn)，RI20這種物質(zhì)可以抑制Hfq與sRNA的相互作用，從而抑制革蘭陰性致病菌毒力基因的表達(dá)，提高細(xì)菌對(duì)H2O2與抗菌藥物的敏感性。因此，Hfq抑制劑的研發(fā)及運(yùn)用有望成為對(duì)抗細(xì)菌耐藥的新策略。

表1 調(diào)控性ncRANs對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性或毒力的調(diào)控機(jī)制

3.2 核糖開關(guān)靶點(diǎn) 嘌呤合成是細(xì)菌繁殖的必需過程，嘌呤核糖開關(guān)廣泛存在于細(xì)菌當(dāng)中。鳥嘌呤類似物5，6-三氨基嘧啶-4-酮配體(PC12)可通過結(jié)合嘌呤核糖開關(guān)抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖[40-41]。類似的核糖開關(guān)如黃素單核苷酸(FMN)核糖開關(guān)，F(xiàn)MN類似物配體在對(duì)抗大腸埃希菌感染時(shí)表現(xiàn)出良好的活性[42-44]。核糖開關(guān)成為解決日益嚴(yán)重耐藥問題的新出口，而這些配體物質(zhì)與抗菌藥物的聯(lián)合運(yùn)用也是一種抗感染治療的新策略。在鮑曼不動(dòng)桿菌中為了防止配體與誘導(dǎo)耐藥基因表達(dá)的核糖開關(guān)(aac/aad)結(jié)合，以期設(shè)計(jì)產(chǎn)生與核糖開關(guān)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合但不改變核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)，不與耐藥基因核糖開關(guān)相互作用的新型小分子物質(zhì)[45]。

3.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù) 在對(duì)抗耐藥基因方面，改造的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已成功應(yīng)用于細(xì)菌。Citorik等[46]構(gòu)建了靶向β-內(nèi)酰胺酶1(NDM-1)基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，幫助細(xì)菌對(duì)抗NDM-1。Kim等[47]運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)恢復(fù)了產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。Sun等[48]運(yùn)用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功敲除了大腸埃希菌中粘菌素耐藥基因mcr-1，使其恢復(fù)了對(duì)多粘菌素的敏感性。寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院研究人員[49]發(fā)明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功敲除鮑曼不動(dòng)桿菌的OXA-23基因，恢復(fù)了其對(duì)亞胺培南的敏感性。將改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)植入耐藥細(xì)菌，并破壞相關(guān)耐藥基因，使耐藥菌重新對(duì)抗菌藥物敏感，也是一種有效的抗感染策略。

4 結(jié)論

鮑曼不動(dòng)桿菌中的調(diào)控性ncRNAs(sRNAs、5’UTR或3’UTR調(diào)控元件、CRISPR)具有穩(wěn)定的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，均具有高度保守性，這種特殊的結(jié)構(gòu)與其調(diào)控細(xì)菌的耐藥性、毒力因子等密切相關(guān)[50-52]。ncRNAs在調(diào)控鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜、藥物外排泵、藥物滅活酶、毒力因子等的表達(dá)，以及抵抗外源耐藥基因的入侵等方面起著關(guān)鍵的作用，從而影響細(xì)菌的耐藥性和毒力。因此，ncRNAs極具作為藥物靶點(diǎn)的潛在價(jià)值，此外針對(duì)Hfq、核糖開關(guān)等靶點(diǎn)研發(fā)新的抗菌物質(zhì)，以及開發(fā)出適用于鮑曼不動(dòng)桿菌的CRISPR/Cas生物靶向制劑，都是解決鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥問題的新思路。但是目前對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌中的調(diào)控性ncRNAs的研究還處在初期探索階段，大量的調(diào)控性ncRNAs，以及其靶基因還有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，調(diào)控性ncRNAs還通過哪些調(diào)控方式參與細(xì)菌的耐藥網(wǎng)絡(luò)也有待進(jìn)一步深入研究。近年來，隨著篩選、鑒定ncRNAs，以及預(yù)測(cè)其靶基因等的分子生物信息學(xué)方法與技術(shù)的發(fā)展[11, 53]，將會(huì)有更多的調(diào)控性ncRNAs及其調(diào)控細(xì)菌耐藥的相關(guān)作用機(jī)制會(huì)被發(fā)現(xiàn)。