宋紹征，李 丹，何正義，張 婷，成 勇，周鳴鳴

1無(wú)錫太湖學(xué)院健康與護(hù)理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，江蘇 無(wú)錫 214000；2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，江西 贛州 341000；3揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院//江蘇省轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥工程研究中心，江蘇 揚(yáng)州 225009

雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指利用基因工程技術(shù)將兩種不同的外源基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)而獲得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過(guò)雙基因共整合獲得的轉(zhuǎn)基因個(gè)體或細(xì)胞能夠產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)作用，從而提高目的基因的表達(dá)水平［1］。將NEP1-40和NT-3雙基因共同轉(zhuǎn)染導(dǎo)入大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白表達(dá)量及NEP1-40和NT-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯地高于單基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞［2］。利用慢病毒載體介導(dǎo)ⅤEGF和Smad7雙基因共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，在靶細(xì)胞中的ⅤEGF和Smad7蛋白出現(xiàn)過(guò)表達(dá)現(xiàn)象［3］。通過(guò)將二氫葉酸還原酶（DHFR）與谷氨酰胺合成酶（GS）單基因及其雙基因（DHFR+GS）共轉(zhuǎn)染CHOdhfr-細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，能夠明顯地影響外源目的基因的表達(dá)水平［1］。通過(guò)轉(zhuǎn)染睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和白血病抑制因子雙基因的研究發(fā)現(xiàn)，能夠顯著提高白血病抑制因子蛋白表達(dá)水平對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)生理作用［4］。但是，這些報(bào)道通常是在細(xì)胞水平的驗(yàn)證研究，由于動(dòng)物個(gè)體基因調(diào)控機(jī)制較復(fù)雜，大多集中在雙基因共表達(dá)和基因表達(dá)載體構(gòu)建優(yōu)化層次的研究［5-7］。例如利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)建立的APPswe/PS1dE9 雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型中，能夠同時(shí)高水平共表達(dá)APP 和PS1 兩種基因［5］；通過(guò)將含有熒光蛋白基因（DsRed1 和Ⅴenus）的重組慢病毒注射到豬的2-細(xì)胞期胚胎中制備了雙轉(zhuǎn)基因豬，經(jīng)檢測(cè)該雙轉(zhuǎn)基因豬能夠共表達(dá)兩種熒光蛋白基因，并可穩(wěn)定地遺傳給下一代［6］；通過(guò) 將 NUP98-PHF23（NP23）和 NUP98-HOXD13（NHD13）基因表達(dá)載體優(yōu)化，重新構(gòu)建融合蛋白來(lái)制備NP23-NHD13雙轉(zhuǎn)基因小鼠，成功地表達(dá)了目標(biāo)基因并在白血病小鼠模型中進(jìn)行研究應(yīng)用［7］。然而，關(guān)于雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物協(xié)同促進(jìn)單一目標(biāo)基因表達(dá)的研究較少見(jiàn)報(bào)道，尤其是GH基因協(xié)同促進(jìn)目標(biāo)基因tPA在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

溶栓藥物現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［8-11］。生長(zhǎng)激素（GH）促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞增殖和乳腺生長(zhǎng)發(fā)育及維持泌乳［12,13］，在動(dòng)物遺育種領(lǐng)域具有重要的功能。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑（tPA）藥用蛋白的研究多集中于單基因表達(dá)［14-17］，而將GH和tPA雙基因共整合入轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)以期提高tPA表達(dá)量的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，在雙轉(zhuǎn)基因小鼠個(gè)體中GH基因是否能夠協(xié)同促進(jìn)外源目的基因tPA表達(dá)水平的提高，這將是研究個(gè)體雙基因協(xié)同促表達(dá)的關(guān)鍵，值得進(jìn)一步深入研究。

本研究主要在前期獲得并飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心的tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠（PCL25/tPA乳腺特異性表達(dá)載體，以β-casein基因作為調(diào)控序列，以CMⅤ為啟動(dòng)子）［18］的基礎(chǔ)上，通過(guò)受精卵顯微注射法額外導(dǎo)入GH基因，旨在提高轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中tPA的表達(dá)量，從而驗(yàn)證GH/tPA雙基因動(dòng)物個(gè)體中GH基因協(xié)同促進(jìn)目的外源基因tPA的表達(dá)作用，同時(shí)GH基因的導(dǎo)入并不影響轉(zhuǎn)基因小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育，為將來(lái)制備高表達(dá)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白和遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌種 PCL25/GH和PCL25/tPA質(zhì)粒、菌種保存于本實(shí)驗(yàn)室，均是哺乳動(dòng)物乳腺特異性表達(dá)載體（以山羊β-casein序列為調(diào)控元件、CMⅤ為啟動(dòng)子，圖1），已分別在山羊細(xì)胞、兔及小鼠個(gè)體上進(jìn)行表達(dá)了驗(yàn)證［14,18,19］。

圖1 PCL25/GH和PCL25/tPA乳腺特異性表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of mammary gland-specific expression vectors PCL25/GH and PCL25/tPA.

1.1.2 主要試劑 FBS（GBICO），HCG（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠），F(xiàn)SH（寧波市三生藥業(yè)有限公司)，鼠抗tPA單克隆抗體、羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP（Santa Cru），戊巴比妥鈉、M2、M16、透明質(zhì)酸酶、蛋白酶Κ（Sigma），DNA 膠回收純化試劑盒（QIAGEN），DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及各種酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，其它未說(shuō)明試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純且購(gòu)自南京生興生物有限公司和國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠2只（BALB/c小鼠，8～10周齡，♂，標(biāo)號(hào)P03、P05，以山羊β-casein基因序列為調(diào)控元件）和正常非轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠30只，均飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，清潔級(jí)，溫度26 ℃，光照12 h（7∶00～19∶00），顆粒飼料，自由飲水。該實(shí)驗(yàn)由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用倫理委員會(huì)審理批準(zhǔn)（(SYXΚ(Su)2019-0044）。

1.1.4 引物 借助于Primer Premier 5.0 軟件完成PCR引物設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)完成引物合成（表1）。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR

1.2 方法

1.2.1 顯微注射用基因片段的準(zhǔn)備 應(yīng)用NotⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切PCL25/GH質(zhì)粒使其線性化，切除原核基因片段，應(yīng)用QIAGEN DNA膠回收純化試劑盒獲取真核基因片段，應(yīng)用TE緩沖液（5mmol/LTris,0.1mmol/L EDTA,pH 7.4）溶解稀釋定量至5 ng/μL，-20 ℃保存，供顯微注射備用。

1.2.2 小鼠超數(shù)排卵與同期發(fā)情 選取5～6周齡的正常非轉(zhuǎn)基因的未發(fā)情雌性BALB/c小鼠作為供體，腹腔注射8 U/只PMSG，間隔48 h后，再腹腔注射8 U/只HCG，然后與tPA單轉(zhuǎn)基因公鼠合籠；同時(shí)選取7～8周齡的正常非轉(zhuǎn)基因的自然發(fā)情雌性BALB/c小鼠作為受體，與結(jié)扎公鼠（常規(guī)手術(shù)輸卵管結(jié)扎的非轉(zhuǎn)基因雄性BALB/c小鼠）合籠制備假孕母鼠。第2天早晨檢查陰道栓情況。

1.2.3 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 將有陰栓的供體鼠脫臼頸椎處死，無(wú)菌打開(kāi)腹腔，取出輸卵管，轉(zhuǎn)移至M2液滴中，撕開(kāi)輸卵管壺腹部以流出卵母細(xì)胞團(tuán)，透明質(zhì)酸酶消化30 s以去除受精卵外周的顆粒細(xì)胞，M16溶液中洗3次，轉(zhuǎn)移至M16培養(yǎng)液中置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min。在熒光倒置顯微鏡（IX70，Olympus）下，將PCL25/GH基因片段注射入受精卵的原核內(nèi)，M16培養(yǎng)0.5 h后移植入經(jīng)0.75%戊巴比妥納麻醉后的假孕母鼠輸卵管內(nèi)，每只移植15～35枚卵，細(xì)心照料懷孕母鼠，待19～21 d仔鼠出生。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠的整合篩選 無(wú)菌剪取新生仔鼠的尾尖組織約0.5～1 cm長(zhǎng)，剪碎后使用苯酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)。分別針對(duì)GH和tPA基因設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物（表1），其中1對(duì)GH-F/R引物可用于GH轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，共32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。另一對(duì)CMⅤ/tPA-F/R引物可用于tPA轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸45 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳成像系統(tǒng)，鑒定其條帶大小是否正確。

1.2.5 ELISA 表達(dá)檢測(cè) 待檢母鼠與正常公鼠進(jìn)行交配，待仔鼠出生3 d后，開(kāi)始收集乳汁。使用PBS緩沖液以1∶1比例稀釋后，4 ℃，10 000g離心20 min；去除上層脂肪后，使用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至4.0，4 ℃，10 000g離心20 min；去除上層酪蛋白渾濁沉淀，吸取上清液，使用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)乳清的pH 至7.0。處理后的乳清添加PBS稀釋100倍用于ELISA檢測(cè)，分別使用鼠抗tPA單克隆抗體作為一抗、羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP作為二抗，孵育、清洗、顯色、酶標(biāo)儀測(cè)定A450nm值，然后以不同濃度的阿替普酶（alteplase）作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算tPA表達(dá)量，并比較GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因和tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)水平。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 使用PBS緩沖液將乳清稀釋100倍，按照常規(guī)方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）［17］。使用轉(zhuǎn)移緩沖液（1.93 g/L tris,9 g/L glycine）將凝膠轉(zhuǎn)移至PⅤDF 膜，300 mA，轉(zhuǎn)印3 h。使用超純水沖洗2 次后，室溫封閉（20 mmol/L Tris,137 mmol/L NaCl,0.1% Tween-20，10% fetal bovine serum，pH 7.6），過(guò)夜。加入1∶2000稀釋的鼠抗tPA單克隆抗體（一抗），37 ℃孵育2 h。使用TTBS（20 mmol/L Tris,137 mmol/L NaCl,1%Tween-20,pH 7.6）洗滌3次，加入1∶2000稀釋的羊抗鼠單克隆抗體IgG-HRP（二抗），37 ℃孵育2 h。取出PⅤDF膜，PBS沖洗3次，加入顯色液（DAB 50 mg，0.05 mol/L TB100 mL，30 μL 30%H2O2，pH7.6），室溫暗室孵育15 min，晾干后觀察。

1.2.7 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育監(jiān)測(cè) 在相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，分別對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因和正常非轉(zhuǎn)基因小鼠（品系相同，BALB/c）0、7、21、35、49、63、77 d日齡小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，然后以時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)、小鼠體質(zhì)量（g）為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，比較GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因與正常非轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)結(jié)果

P03 tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠成功與5只供體鼠配種，獲得286枚受精卵，經(jīng)顯微注射后，選取其中形態(tài)較好的249枚卵移植入12只假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，有8只懷孕，妊娠率為66.7%（8/12），共出生77只小鼠。應(yīng)用GH-F/R引物（位于GH基因編碼區(qū)，GH-F引物序列位置在PCL25/GH載體為4512-4545，GH-R引物序列位置在PCL25/GH載體為5145-5181）可進(jìn)行PCR檢測(cè)GH基因整合情況，若整合GH基因則擴(kuò)增出670 bp大小的條帶；應(yīng)用CMⅤ/tPA-F/R（位于橫跨CMⅤ-tPA基因序列接頭處，CMⅤ/tPA-F引物序列位置在PCL25/tPA載體為3874-3890，CMⅤ/tPA-R引物序列位置在PCL25/tPA載體為4418-4434）可進(jìn)行PCR檢測(cè)tPA基因整合情況，若整合tPA基因則擴(kuò)增出561 bp大小的條帶；若PCR檢測(cè)為GH/tPA雙基因共整合，則能夠分別擴(kuò)增出670 bp和561 bp大小的兩條帶，驗(yàn)證結(jié)果可判定為GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)PCR檢測(cè)，共有16只小鼠（7♂，9♀）整合tPA單基因，僅擴(kuò)增出561 bp大小條帶；共有13只小鼠（8♂，5♀）整合GH/tPA 雙基因，分別擴(kuò)增出670 bp 和561 bp大小條帶（圖2），雙基因整合率為16.9%（13/77）（表2）。

圖2 GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因的PCR檢測(cè)電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of the PCR products for GH/tPA double transgenic mice.A:Detection of tPA gene by PCR.Lanes 1-7:Genome samples of transgenic mice;Lane 8:PCL25/tPA plasmid (positive control);Lane 9:Wild-type mouse (negative control);Lanes 10,11:Ultrapure water(blank control);M:DL2000 marker.B:Detection of GH gene by PCR.Lanes 1-7:Genome samples of transgenic mice;Lane 8:PCL25/GH plasmid (positive control);Lane 9:Wild-type mouse(negative control);Lane 10:tPA single transgenic mice;Lane 11:Ultrapure water (blank control);M:DL2000 marker.

P05 tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠成功與3只供體鼠配種，獲得175枚受精卵，經(jīng)顯微注射后，選取其中形態(tài)較好的144枚卵移植入7只假孕母鼠的輸卵管內(nèi)，有4只懷孕，妊娠率為57.1%（4/7），共出生34只小鼠。應(yīng)用PCR檢測(cè)，有12只小鼠（5♂，7♀）整合tPA單基因，僅擴(kuò)增出561 bp大小條帶；有7只小鼠（3♂，4♀）整合GH/tPA雙基因，分別擴(kuò)增出561 bp和670 bp大小條帶（圖2），雙基因整合率為20.6%（7/34）（表2）。

表2 轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)情況統(tǒng)計(jì)表Tab.2 Production statistics of the transgenic mice

2.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)基因小鼠乳清經(jīng)ELISA檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算并統(tǒng)計(jì)分析乳腺中tPA的表達(dá)情況（表3、圖3），其中P03 系生產(chǎn)的tPA 單轉(zhuǎn)基因小鼠的tPA 表達(dá)量為16.3～82.5 μg/mL，GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠的tPA表達(dá)量為35.2～674 μg/mL；P05系生產(chǎn)的tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠的tPA表達(dá)量為20.8～66.3 μg/mL，GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠的tPA表達(dá)量為112～423 μg/mL。兩個(gè)品系生產(chǎn)的GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)tPA水平均明顯高于tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠（P＜0.05），且最高表達(dá)水平達(dá)到674 μg/mL。

圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中tPA的表達(dá)量及分析Fig.3 Expression of tPA in the mammary gland of the transgenic mice.A:Standard curve of tPA expression in the mammary glands of transgenic mice.The concentrations of ateplase standard were 0,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 and 8.0 μg/mL,respectively.All whey samples were diluted at 100 folds with PBS.B:The expression level of tPA in the mammary gland of the transgenic mice.P03-S and P05-S are tPA single transgenic mice,and P03-D and P05-D are GH/tPAdouble transgenic mice.*P＜0.05 vs tPAsingle transgenic mice.

表3 單、雙轉(zhuǎn)基因小數(shù)tPA表達(dá)情況分析表Tab.3 The tPAof Gene expression analysis of single and double transgenic mice(μg/mL)

2.3 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

小鼠乳清的Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，單、雙轉(zhuǎn)基因小鼠乳清中均出現(xiàn)一條約68 000大小的條帶，與阿替普酶標(biāo)準(zhǔn)品的條帶大小一致（圖4），與目標(biāo)蛋白大小相符合。

圖4 單、雙轉(zhuǎn)基因小鼠乳清的Western blotting檢測(cè)圖Fig.4 Western blotting of ateplase in single and double transgenic mice whey.All whey samples were diluted 100 times with PBS.M:Protein molecular weight standard;1:Alteplase standard (positive control);2:Na?ve mouse whey(negative control);3:PBS(blank control);4:Double transgenic mouse whey produced from P03;5:Single transgenic mouse whey produced from P03;6:Double transgenic mouse whey produced from P05;7:Single transgenic mouse whey produced from P05.

2.4 GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況

分別對(duì)單、雙轉(zhuǎn)基因小鼠的不同日齡體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量（表4），并與正常非轉(zhuǎn)基因小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示所有小鼠的體質(zhì)量間沒(méi)有明顯的差異（P＞0.05，表4）。GH基因的轉(zhuǎn)入未影響小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育，GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠能夠正常出生、存活，并且健康地生長(zhǎng)發(fā)育至成年。

表4 轉(zhuǎn)基因小鼠不同生長(zhǎng)階段的體質(zhì)量測(cè)量統(tǒng)計(jì)表Tab.4 Body weight measurements in different growth stages of the transgenic mice(g,Mean±SD)

3 討論

tPA是一種臨床上用于治療腦中風(fēng)、冠心病、心肌梗死等心腦血栓類疾病的藥物，作為溶栓藥物其具有高效、特異、安全、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在人類血栓疾病治療史上具有重要的地位［10,19］。傳統(tǒng)的tPA生產(chǎn)方式主要是通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或原核生物表達(dá)，價(jià)格高、產(chǎn)量少、生物活性低，臨床使用具有一定的局限性［19］。動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器具有成本低、產(chǎn)量大、生物活性高等優(yōu)勢(shì)［14］，是一種理想的選擇，成為國(guó)內(nèi)外生物高技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)的熱點(diǎn)。自上世紀(jì)末，Wright等［20］首次在羊乳腺中表達(dá)人α-抗胰蛋白酶以來(lái)，為利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)tPA類溶栓藥物提供了可靠的依據(jù)。但是，由于tPA屬于一種非乳蛋白類物質(zhì)，在動(dòng)物乳腺中的表達(dá)水平一直較低，而乳蛋白在乳腺中的表達(dá)機(jī)制十分復(fù)雜［19］。因此，如何提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中外源基因tPA的表達(dá)水平值得我們深入研究。目前，國(guó)內(nèi)外大多是針對(duì)tPA本身基因的優(yōu)化與改造的研究［15,21,22］，雖然取得了一定的進(jìn)展，但是對(duì)于提高tPA表達(dá)產(chǎn)量方面的研究仍有不足。

研究報(bào)道生物體內(nèi)轉(zhuǎn)入兩種基因可產(chǎn)生相互作用，從而協(xié)同促進(jìn)外源目的基因的表達(dá)［23］，這為本研究提高轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中tPA表達(dá)量提供了新的思路。自生長(zhǎng)激素被發(fā)現(xiàn)以來(lái)［24］，隨后有研究證明GH基因能夠與α-LA或β-casein基因的HRE序列結(jié)合并激活受體，協(xié)同促進(jìn)提高動(dòng)物乳蛋白的特異性表達(dá)和乳腺上皮細(xì)胞的分化、增殖［12,25］。雖然對(duì)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞、人體細(xì)胞的研究能夠很好地證明雙基因協(xié)同促表達(dá)這一現(xiàn)象［2,4,26,27］，但是涉及到動(dòng)物個(gè)體的基因表達(dá)調(diào)控較復(fù)雜，目前國(guó)內(nèi)外一般是圍繞基因表達(dá)載體構(gòu)建優(yōu)化或雙基因共表達(dá)等方面來(lái)開(kāi)展研究。例如利用山羊β-酪蛋白、牛αs1-酪蛋白和山羊β-乳球蛋白等不同的啟動(dòng)子序列優(yōu)化設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一系列雜合啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的hLF乳腺特異性表達(dá)載體，通過(guò)顯微注射制備的轉(zhuǎn)基因小鼠中啟動(dòng)子/增強(qiáng)子基因能夠促進(jìn)外源目的基因hLF 在乳腺中高水平地表達(dá)［28］；周敏雅等［29］將hSOD1、hSOD3基因載體共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞獲得雙轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，進(jìn)而通過(guò)體細(xì)胞核移植制備的雙轉(zhuǎn)基因山羊體內(nèi)能夠成功地同時(shí)高水平共表達(dá)hSOD1、hSOD3這兩種基因；其他研究也分別證明了雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中基因構(gòu)建優(yōu)化促表達(dá)和雙基因共表達(dá)的情況［6,7］。然而，關(guān)于利用GH基因的導(dǎo)入來(lái)協(xié)同提高外源目的基因tPA在雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體中的表達(dá)水平，尤其是關(guān)于GH/tPA雙基因小鼠個(gè)體協(xié)同促表達(dá)分析的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況Fig.5 Weight gain of the transgenic mice.A:The growth curve of transgenic mice.N:Na?ve mice;P03-S:tPA single transgenic mice;P03-D:GH/tPA double transgenic mice;P05-S:tPA single transgenic mice;P05-D:GH/tPA double transgenic mice.B:Comparison of body weight of the mice at 77 days.▲P＞0.05 vs normal non transgenic mice.

小鼠是一種常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物，具有繁殖力強(qiáng)、產(chǎn)仔數(shù)多、成長(zhǎng)快、體型小、易于飼養(yǎng)管理等特點(diǎn)，受到廣大科研者的青睞［30,31］。本研究通過(guò)前期獲得的tPA單轉(zhuǎn)基因雄性小鼠（標(biāo)號(hào)P03、P05）與正常雌性小鼠交配獲取受精卵、顯微注射GH基因的方法來(lái)制備GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠，從而保證了雙基因整合率和tPA表達(dá)水平的可比性。共獲得13只P03系GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠（8♂，5♀），7只P05系GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠（3♂，4♀），雙基因整合率分別為16.9%和20.6%，這與通常制備轉(zhuǎn)基因小鼠整合效率的研究報(bào)道相一致［16,21,32］。同時(shí)，關(guān)于tPA在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中的表達(dá)水平研究一直備受國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注。Ebert等［15］首次報(bào)道了利用轉(zhuǎn)基因羊來(lái)生產(chǎn)tPA，在其乳腺中成功地表達(dá)3μg/mL具有活性的tPA。在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺特異性表達(dá)tPA的相關(guān)研究報(bào)道也屢見(jiàn)不鮮，例如Lu等［21］通過(guò)顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中能夠表達(dá)出6μg/mL的tPA，安靚等［22］通過(guò)乳腺注射法和顯微注射法分別在小鼠乳腺中表達(dá)出300 ng/mL和500 ng/mL的tPA，Zhou等［16］和譚曉紅等［17］也分別成功地制備了轉(zhuǎn)基因小鼠并研究了其乳腺中tPA表達(dá)水平。但是，上述研究的tPA表達(dá)水平一直偏低，未得到科學(xué)有效的解決。在本研究中，對(duì)單、雙轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，其中tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中表達(dá)tPA的最高水平為82.5 μg/mL，GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中表達(dá)tPA的最高水平為674 μg/mL，雙基因小鼠表達(dá)水平明顯高于單基因，證明了轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)導(dǎo)入GH基因，能夠較大程度地促進(jìn)目的基因tPA的表達(dá)，提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的量。這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道相比，能夠大大地改善并提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中tPA的表達(dá)水平，在一定程度上可解決目前臨床tPA產(chǎn)量低的瓶頸問(wèn)題。

此外，目前關(guān)于GH基因的研究通常是利用GH基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)以調(diào)節(jié)其機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，從而獲得比一般野生型個(gè)體大的“超級(jí)”物種［33］，而利用GH基因調(diào)控乳蛋白表達(dá)和泌乳研究的報(bào)道較少見(jiàn)。本研究中獲得的GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)與tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠、正常非轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育狀況比較，發(fā)現(xiàn)GH基因并沒(méi)有對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，整合GH的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠正常地出生、成長(zhǎng)至成年。一般情況下，BALB/c小鼠生長(zhǎng)至6周齡達(dá)到性成熟、8周齡達(dá)到體成熟，成年體質(zhì)量為22.0～28.0 g［34］，本研究中的小鼠生長(zhǎng)至約49日齡以后，達(dá)到一般成年小鼠體質(zhì)量，而且整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)，單、雙轉(zhuǎn)基因與正常非轉(zhuǎn)基因小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)均沒(méi)有明顯的差異，這與一般利用GH基因促生長(zhǎng)的研究報(bào)道不一致。分析原因可能是本研究中選擇的GH基因序列來(lái)源于山羊，由于基因種屬的因素，導(dǎo)致GH基因在小鼠體內(nèi)不能夠產(chǎn)生與山羊類似的生理作用，所以沒(méi)有對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育造成任何明顯的影響。而且，基因表達(dá)是涉及到基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、整合位點(diǎn)、拷貝數(shù)、激素水平以及表觀遺傳多態(tài)性等多方面因素的影響［35,36］。因此，有必要對(duì)相關(guān)后續(xù)工作進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究在tPA單轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上成功制備了GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)對(duì)乳清中tPA表達(dá)含量和不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的體質(zhì)量監(jiān)測(cè)，證明了GH/tPA雙轉(zhuǎn)基因小鼠能夠顯著地提高目的基因tPA的表達(dá)水平，且GH基因?qū)π∈蟮纳L(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有造成任何明顯的影響，這為將來(lái)制備高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠及其它動(dòng)物提供了新思路和新方法，也為新型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白和轉(zhuǎn)基因育種奠定了基礎(chǔ)。