武波飛，丁志雯，蘇永成，楊光，侯曉月，房耀維,2，劉姝,2*

(1.江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222000)

南美白對蝦又稱白腳蝦(Penaeusvannamei)，是對蝦科、對蝦屬蝦類，是迄今世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良蝦種之一[1]。南美白對蝦蛋白質(zhì)含量較高，富含氨基酸、維生素和礦物質(zhì)元素，蝦肉中多不飽和脂肪酸(EPA和DHA)含量豐富，具有一定的保健功能[2]。南美白對蝦蝦殼比較柔軟，蝦肉、蝦殼容易剝離，質(zhì)地松軟[3]。我國南美白對蝦淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為67.12萬噸，海水養(yǎng)殖產(chǎn)量為114.44萬噸，占甲殼類水產(chǎn)品養(yǎng)殖總產(chǎn)量的32%[4]。蝦肉富含蛋白質(zhì)和18種氨基酸，其中必需氨基酸占氨基酸總數(shù)的38.78%，是一種營養(yǎng)均衡的優(yōu)質(zhì)蛋白來源[5-6]。目前，南美白對蝦出口數(shù)量越來越大，會產(chǎn)生大量的蝦殼及蝦頭廢棄物，這部分約占蝦總量的30%～40%[7]。以干基計(jì)，這些廢棄物蝦殼中占5.21%的蛋白質(zhì)、5.32%的礦物質(zhì)、6.77%的幾丁質(zhì)和1.29%的脂肪[8]。這些廢棄物不僅造成了營養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)，而且造成了環(huán)境污染，導(dǎo)致水環(huán)境的富營養(yǎng)化。如果能對這些廢棄物進(jìn)行開發(fā)利用，則可變廢為寶，既解決了環(huán)境污染，又帶來了經(jīng)濟(jì)效益。

幾丁質(zhì)(chitin)，又稱殼多糖、甲殼素，是自然界中唯一的天然堿性多糖，無毒性、無刺激性、無免疫抗原性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工和保健食品等領(lǐng)域[9]。幾丁質(zhì)的溶解性較差，經(jīng)脫除乙?；_(dá)到55%以上后形成殼聚糖。殼聚糖的溶解性能好，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性，并能進(jìn)行化學(xué)修飾反應(yīng)。因此，殼聚糖被認(rèn)為是極具應(yīng)用潛力的功能性生物材料，廣泛應(yīng)用于食品、輕工、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、美容等領(lǐng)域[10]。

由蝦殼制備幾丁質(zhì)最關(guān)鍵的步驟之一是脫蛋白。傳統(tǒng)的脫蛋白方法是濃堿法。該方法對幾丁質(zhì)的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，耗能高，其中的蛋白、碳酸鈣和其余礦物質(zhì)均作為廢棄物排放，會對環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重污染。運(yùn)用添加蛋白酶水解的方式脫蛋白可以大大降低環(huán)境污染，減少能耗，但是成本較高[11]。運(yùn)用產(chǎn)蛋白酶微生物對蝦蟹殼進(jìn)行發(fā)酵脫蛋白綠色環(huán)保，水解產(chǎn)物用回收利用且成本較低，成為極具潛力的蝦蟹殼脫蛋白方式[12-13]。本課題組從海洋樣品中篩選獲得了產(chǎn)耐有機(jī)溶劑蛋白酶菌株B.amyloliquefaciensMSP05[14]。本研究利用B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料

1.1 材料與試劑

南美白對蝦蝦殼：青島康鏡海洋生物科技有限公司；發(fā)酵菌種：B.amyloliquefaciensMSP05菌，于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保藏；酵母粉、蛋白胨：美國OXOID公司；可溶性淀粉、MnSO4、FeSO4、MgSO4、Tween-20、NaH2PO4、K2HPO4：南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MC型電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FE20型pH計(jì) 上海梅特勒-托利多有限公司；JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JXN-26型高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蝦殼預(yù)處理

將蝦殼在100 ℃烘干至恒重，使用組織搗碎機(jī)破碎，過篩40目粒徑的蝦殼。

1.3.2 菌種活化

在無菌條件下，從斜面接種至LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃以180 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8后作為種子液。按4%接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂2 g/L，pH 7.2～7.4，在121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：液體LB培養(yǎng)基。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉14.06 g/L，蛋白胨16.28 g/L，酵母膏2.5 g/L，MnSO40.1 g/L，Tween-20 0.1 g/L，NaH2PO43.46 g/L，K2HPO41 g/L，F(xiàn)eSO40.1 g/L，MgSO40.1 g/L，蝦殼處理物10%，pH 6.7，在121 ℃滅菌20 min。

1.3.4 南美白對蝦蝦殼蛋白質(zhì)的測定

參照國標(biāo)GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

1.3.5 南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的測定

稱取20 g南美白對蝦蝦殼，用200 mL 6% NaOH溶液煮沸1 h，用紗布過濾，將濾渣水洗至中性，用5%的HCl溶液浸泡24 h，每4 h攪拌一次，紗布過濾，將濾渣水洗至中性后烘干，測定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算脫蛋白率[15]。

蛋白質(zhì)去除率(%)=(原料中總蛋白質(zhì)量-濾渣中蛋白質(zhì)量)/原料中總蛋白質(zhì)量×100。

1.3.6 發(fā)酵條件對產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白的影響

發(fā)酵時(shí)間60 h，發(fā)酵轉(zhuǎn)速200 r/min，初始pH 6.7，發(fā)酵溫度37 ℃，裝液量20%，接種量4%，蝦殼處理物10%。依次對發(fā)酵時(shí)間(0，12，24，36，48，60，72 h)、發(fā)酵轉(zhuǎn)速(160，180，200，220 r/min)、初始pH值(6.3，6.5，6.7，6.9，7.1)、發(fā)酵溫度(35，37，39，41 ℃)、裝液量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、接種量(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以脫蛋白率為指標(biāo)，探討蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦殼脫蛋白的影響。

1.3.7 響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白條件

根據(jù)單因素結(jié)果，選擇對發(fā)酵脫蛋白影響最顯著的轉(zhuǎn)速、溫度和裝液量為因素，以脫蛋白率高低為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 11設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)[16]。在最佳條件下對響應(yīng)面分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，測定脫蛋白率。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為重復(fù)3次試驗(yàn)后的平均值，響應(yīng)值試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 11軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 2018軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

發(fā)酵時(shí)間對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖1可知，脫蛋白率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而不斷增加，在菌株發(fā)酵培養(yǎng)48 h時(shí)，脫蛋白率達(dá)到最高值91.94%，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，脫蛋白率下降。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子不斷地消耗，菌株產(chǎn)蛋白酶水平下降[17]。

2.1.2 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖2可知，轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)脫蛋白率最高，為94.99%，轉(zhuǎn)速在160～200 r/min之間，隨著轉(zhuǎn)速的增加，蛋白酶活力增大，說明轉(zhuǎn)速增大，溶氧增大，有利于產(chǎn)酶；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于200 r/min時(shí)，蛋白酶活力不再升高反而有所下降，可能是轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，剪切力會導(dǎo)致蛋白酶失活[18]。

圖2 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對發(fā)酵時(shí)間對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.2 Effect of rotating speed on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

2.1.3 初始pH對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

發(fā)酵初始pH對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響見圖3。

圖3 初始pH對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.3 Effect of initial pH value on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖3可知，隨著初始pH的升高，脫蛋白率先升高后下降，在初始pH值為6.7時(shí)最高，脫蛋白率為91.65%。pH影響酶的活性和穩(wěn)定性，從而影響脫蛋白效率[19]。

2.1.4 發(fā)酵溫度對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖4可知，在39 ℃時(shí)脫蛋白率達(dá)到最高95.49%，當(dāng)溫度超過39 ℃時(shí)，脫蛋白率持續(xù)下降。溫度影響微生物發(fā)酵產(chǎn)酶水平，也影響酶活性，從而影響蛋白脫除率[20]。

圖4 發(fā)酵溫度對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

續(xù) 表

2.1.5 裝液量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

裝液量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 裝液量對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.5 Effect of liquid loading volume on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

由圖5可知，當(dāng)搖瓶的裝液量為20%時(shí)，脫蛋白率達(dá)到最高值，為90.75%。裝液量與發(fā)酵液溶氧相關(guān)，裝液量過高，溶氧偏低，導(dǎo)致菌株生長變緩，發(fā)酵產(chǎn)酶水平降低。

2.1.6 接種量對B.amyloliquefaciensMSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響

由圖6可知，接種量的大小影響脫蛋白的效率。接種量為4%時(shí)，脫蛋白率達(dá)到最高值90.35%。進(jìn)一步增加接種量，脫蛋白率不再顯著增加。接種量過小會導(dǎo)致菌株延滯期變長、發(fā)酵產(chǎn)酶水平低。考慮到成本問題，選擇4%為最佳接種量。

圖6 接種量對B. amyloliquefaciens MSP05南美白對蝦蝦殼脫蛋白率的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on deproteinization rate of Penaeus vannamei shells fermented by B. amyloliquefaciens MSP05

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)蛋白酶B. amyloliquefaciens MSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以發(fā)酵轉(zhuǎn)速B(r/min)、溫度(℃)和裝液量(%)為顯著影響因素，見表1。運(yùn)用Design Expert 11設(shè)計(jì)三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的Box-Behnken進(jìn)行組合優(yōu)化，其中包括5個(gè)最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化法各因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 The factors and levels of response surface experiment

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The response surface experiment design and results

利用Design Expert 11軟件對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到以Y為因變量，發(fā)酵轉(zhuǎn)速、溫度和裝液量為自變量的二次多項(xiàng)式方程：Y=93.89+2A-2.4B+0.4775C+0.1075AB-3.57AC+3.92BC-0.1278A2-3.04B2-8.92C2。

使用Design Expert進(jìn)一步對擬合出的回歸方程進(jìn)行誤差統(tǒng)計(jì)分析，對方差和多元相關(guān)系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，對此模型進(jìn)行方差分析及顯著性變化，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 The variance analysis and coefficient significance test of regression model

由表3可知，回歸模型的P值為0.0001，顯著性分析(P<0.01)為極顯著；失擬項(xiàng)的P值為0.8511>0.05，說明模型的擬合程度良好，影響擬合的因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小[21]。A、B、AC、BC、B2和C2對脫蛋白效果的影響極顯著。方程的決定系數(shù)R2=0.9760>0.9，表明產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦殼脫蛋白率預(yù)測結(jié)果具有一致性，模型相關(guān)度好。試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男Ｕ禂?shù)RAdj2=0.9450，表明模型的擬合程度較高[22]，說明有94.5%的試驗(yàn)結(jié)果可以用此模型來解釋，因此結(jié)果可靠，模型可以對產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦殼脫蛋白率值進(jìn)行分析和預(yù)測，由回歸方程式中一次項(xiàng)系數(shù)可知，各因素對產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白率作用大小順序?yàn)椋簻囟?B)>轉(zhuǎn)速(A)>裝液量(C)。

2.2.2 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

響應(yīng)曲面的形狀反映各因素間的交互作用的顯著性，響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著，曲面頂點(diǎn)為交互因素最佳取值的試驗(yàn)結(jié)果[23-24]。由圖7可知，溫度與轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)速與裝液量以及裝液量與溫度交互作用的顯著性與表3中交互項(xiàng)P值的分析結(jié)果一致，(a)，(c)，(e)均呈橢圓形，表明因素間的交互作用顯著，等高線的形狀可以判斷交互作用的強(qiáng)弱，3組等高線圖中轉(zhuǎn)速和溫度作用最好，等高線中的曲面圍繞著響應(yīng)面在中間處形成頂點(diǎn)，即脫蛋白率最大值，a，c，e響應(yīng)面圖開口朝下，隨著每個(gè)因素的增加而響應(yīng)值減小，響應(yīng)面的頂點(diǎn)即為最大響應(yīng)值。

(a)

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design Expert 11軟件得到脫蛋白的最佳發(fā)酵工藝：轉(zhuǎn)速200.5 r/min、溫度38.5 ℃、裝液量19.5%。為方便實(shí)際操作，將最佳工藝條件設(shè)為：轉(zhuǎn)速200 r/min、溫度39 ℃、裝液量20%。在此條件下做3次試驗(yàn)，脫蛋白率達(dá)95.40%±0.014%，接近理論預(yù)測值96.47%。

2.2.4 熱堿法脫南美白對蝦蝦殼蛋白

利用熱堿法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白，脫蛋白率達(dá)到 97.8%±2.1%，高于最佳條件下發(fā)酵法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白率。但是熱堿法能耗高，排出大量污染廢水，污染環(huán)境。另外，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿對幾丁質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有一定的破壞[25]。因此，本研究優(yōu)化獲得的發(fā)酵法脫除南美白對蝦蝦殼蛋白綠色環(huán)保、能耗較低，具有工業(yè)應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

以 南美白對蝦蝦殼為原料，采用產(chǎn)蛋白酶B.amyloliquefaciensMSP05通過發(fā)酵南美白對蝦蝦殼脫蛋白，以脫蛋白率為考察指標(biāo)，脫蛋白率為80.28%。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，最終獲得最佳發(fā)酵脫蛋白參數(shù)為：轉(zhuǎn)速200 r/min、溫度39 ℃、裝液量20%。在此條件下得到的脫蛋白率為96.47%，較優(yōu)化前提高了16.7%。