張艷芳，孟廣超,2，王選年,2*

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450001)

對微生物進行高質(zhì)量與高生產(chǎn)能力的改造，是當(dāng)前發(fā)酵生產(chǎn)行業(yè)的核心，前人對米曲霉菌株的誘變方法主要有紫外誘變、DES復(fù)合誘變和離子注入誘變等，這些方法均能有效地提高米曲霉產(chǎn)各類蛋白酶的活性[1-3]。但是這些方法效率低、盲目性大、工作量高，不適合當(dāng)今迅速發(fā)展的社會，正逐漸被社會淘汰。近幾年，新興起的常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術(shù)對米曲霉菌株進行誘變育種，與傳統(tǒng)的誘變方法相比，它具有操作簡便、可行性高、安全無污染等特點，逐漸取代傳統(tǒng)的育種方式，成為育種界新的傳統(tǒng)，國內(nèi)的科研工作者利用ARTP技術(shù)進行誘變育種，且均取得了不錯的成績[4-5]。本實驗以米曲霉CICC2066為氨肽酶的來源菌株，因為該菌株性能穩(wěn)定，產(chǎn)蛋、白酶活性高，廣泛運用于工業(yè)生產(chǎn)中。采用ARTP誘變技術(shù)，旨在獲得高產(chǎn)突變的產(chǎn)氨肽酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米曲霉(Aspergillusoryzae)CICC2066：本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器

L-亮氨酸-4-硝基苯胺(分析純)：索萊寶公司；72s分光光度計：美國IBAK公司；ARTP誘變育種儀：無錫天幕源生物有限公司；其他有機試劑：均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

米曲霉斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，將土豆清洗干凈、切片、去皮，在沸水中煮20 min，用4層紗布過濾掉濾渣，加入15 g瓊脂，于121 ℃滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基：蔗糖30 g/L，L-亮氨酸對硝基苯0.5 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，磷酸氫二鉀10 g/L，瓊脂粉17 g/L，無菌水1000 mL，pH 6.4，于121 ℃滅菌20 min。

制曲培養(yǎng)基：將16 g麩皮、4 g豆粕共20 g置于250 mL三角瓶中，加入16 g的水，用玻璃棒攪拌均勻，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 誘變材料的選擇

選取米曲霉培養(yǎng)72 h時嫩綠色的孢子為誘變材料，因為這個時期的孢子活躍度高，更易突變，且孢子為單倍體，與菌絲體相比更容易發(fā)生突變且能獲得穩(wěn)定遺傳的突變菌株[6]。

1.2.2 孢子懸液的制備

用于誘變的米曲酶孢子數(shù)目要足夠多，因為誘變是不定向的，誘變以后的米曲霉孢子死亡率在70%以上，剩余的孢子中部分沒有突變，部分發(fā)生負突變，正突變孢子數(shù)目很少，所以孢子數(shù)目要足夠多，否則很難選擇需要的菌株[7]。將斜面保存的米曲酶CICC2066菌株置于35 ℃的培養(yǎng)箱中活化，用無菌水洗脫斜面上的孢子，用轉(zhuǎn)子將洗下的孢子振蕩打散，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子液的濃度調(diào)整為1×107個/mL備用。

1.2.3 致死率的確定

將制備好的孢子液均勻地涂在ARTP誘變儀的玻片上，調(diào)整好功率為120 W 氣流量為10 SLM，以30 s為時間間隔在等離子誘變儀上分別處理0，30，60，90，120，150，180，210，240，270，300 s，將誘變后的菌落分別稀釋10-3，10-4，10-5進行涂布培養(yǎng)72 h，計算菌落的致死率。

致死率=(誘變前菌落數(shù)-誘變后菌落數(shù))/誘變前菌落數(shù)×100%。

1.2.4 ARTP誘變后的篩選

LNA被氨肽酶水解生成pNA而留下黃色的水解圈，根據(jù)HE值(水解圈直徑/菌落直徑)的測定進行初次篩選，與對照組相比，HE值增大的菌株記為正突變株，做好標(biāo)記，并移入PDA培養(yǎng)基，在35 ℃條件下培養(yǎng)，為復(fù)篩做準(zhǔn)備。

復(fù)篩以氨肽酶活性為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在初次篩選的基礎(chǔ)上將初篩獲得的菌株接種到制曲培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)72 h，分別檢測氨肽酶活性，與對照菌株比較，并記錄生長情況。

1.2.5 粗酶液的獲取

稱取1 g固體干曲，用pH為7.2的PBS浸泡，并于4 ℃過夜，用4層紗布過濾得到氨肽酶的粗酶液。

1.2.6 氨肽酶活性檢測

采用L-亮氨酸對硝基苯胺法檢測氨肽酶活性[8]：將獲得的粗酶液在4 ℃，8000×g的條件下離心5 min，取上清液，用pH值為7.2的PBS稀釋10倍。取100 μL稀釋后的氨肽酶粗液在100 ℃水浴滅活20 min，用作對照。分別取滅活的酶液與未滅活的酶液，加入1.5 mL的PBS，在40 ℃條件下恒溫10 min，使其溫度穩(wěn)定，向EP管中加入濃度為25 mmol/L的對硝基苯胺乙醇溶液100 μL，在水浴中40 ℃反應(yīng)10 min，在405 nm下測定其吸光值。

酶活定義：在40 ℃、pH 7.2時，氨肽酶每1 min水解亮氨酸對硝基苯胺生成1 μg對硝基苯胺(p-NA)所需的酶量為一個酶活力單位。

酶活力計算公式：U=A×V1×D÷(K×t×V2)。

式中：U為氨肽酶活性(U/mL)，A為405 nm下的吸光值，V1為反應(yīng)總體積1.7 mL，D為酶液的稀釋倍數(shù)10，t為反應(yīng)時間10 min，K為消光系數(shù)倍數(shù)，V2為酶液體積100 μL。

亮氨酸對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以無水乙醇為空白對照，配制濃度梯度為0，0.5，1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5 μg/mL的對硝基苯胺溶液，用紫外分光光度計在405 nm波長下測定其吸光值，以對硝基苯胺的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以不同濃度對硝基苯胺的吸光值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 誘變后菌株的遺傳穩(wěn)定性檢測

將篩選得到的誘變后的米曲霉菌株在PDA斜面培養(yǎng)基上連續(xù)傳代5次，每代都檢測其氨肽酶活性，并記錄其菌落生長狀況(菌落顏色、菌落大小、產(chǎn)孢子時間等)并與對照菌株(CICC2066)進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-亮氨酸對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.2.6中不同濃度的對硝基苯胺吸光值的檢測建立L-亮氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of p-NA

由圖1可知，L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=0.0329x+0.0014，其中R2為0.9944，證明該曲線可用，同時根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以求得消光系數(shù)K=0.0329。

2.2 ARTP誘變條件的確定

2.2.1 ARTP誘變時間的確定

在ARTP誘變功率為120 W、氣流量為10 SLM、孢子液濃度為1×107個/mL的條件下對米曲霉孢子進行誘變處理，將誘變過后的孢子梯度稀釋并涂布培養(yǎng)，通過確定菌落的致死率進而確定誘變時間，菌落致死率隨時間變化的關(guān)系見圖2。

圖2 誘變時間與致死率的關(guān)系Fig.2 The relationship between mutagenesis time and lethality rate

由圖2可知，隨著誘變時間的增加，米曲霉菌落的致死率也逐漸增加，在時間為0～120 s時，菌落致死率增加較快，120～160 s時菌落致死率增加較慢，在誘變時間達到200 s時，致死率達到100%，查閱文獻可知，米曲霉在致死率達到75%左右時正突變率最高[9]，在實驗中120～150 s以后菌落致死率曲線較為平緩，因此本實驗采用的誘變時間為120 s，在此條件下菌落的致死率為75%。

2.2.2 ARTP孢子濃度的確定

為確定ARTP誘變技術(shù)中孢子液的濃度(初始孢子液的濃度為1×107個/mL)，采用梯度稀釋法對初始孢子液的濃度分別稀釋10-3，10-4，10-5倍，將稀釋后的孢子懸液在35 ℃下培養(yǎng)72 h，根據(jù)平板菌落計數(shù)法確定菌落數(shù)量，進而確定ARTP技術(shù)中孢子液的濃度。

由表1可知，在誘變時間為120 s時，當(dāng)稀釋倍數(shù)為10-3時，菌落生長太過密集，無法計數(shù)，在稀釋倍數(shù)為10-5時，經(jīng)誘變后菌落數(shù)只有8個，在稀釋倍數(shù)為10-4時，經(jīng)誘變后菌落數(shù)為33個，參考GB 4789.2-2016 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》菌落數(shù)在30～100具有計數(shù)意義[10]，所以最終確定稀釋倍數(shù)為10-4，即ARTP誘變技術(shù)中孢子液的濃度為1×103個/mL。

表1 不同稀釋倍數(shù)下的菌落計數(shù)Table 1 The colony count under different dilution multiples

2.3 ARTP篩選結(jié)果

在誘變時間120 s、儀器氣流量10 SLM、功率120 W、孢子懸液濃度為1×103個/mL時，對米曲霉CICC2066進行ARTP誘變處理，將處理過的孢子懸液均勻涂布到氨肽酶活力篩選培養(yǎng)基上，以CICC2066為對照，挑取HE值較CICC2066增大的20菌株進行培養(yǎng)，誘變菌株HE值見表2。

表2 出發(fā)菌株和各誘變菌株的HE值Table 2 The HE values of original strains and mutagenic strains

由表2可知，CICC2066的HE值為1.28，M5的HE值最大，為1.65，比CICC2066高1.23倍，初步說明該菌株的產(chǎn)酶能力較其他菌株強，在培養(yǎng)過程中，M5菌株在48 h左右菌落顏色就變成黃綠色，產(chǎn)生大量孢子，此時其他菌落為白色，或者剛有孢子出現(xiàn)，說明M5菌株較其他菌株生長更快。將初次篩選得到的20株誘變菌株保存到PDA斜面上備用以及進行下一步的復(fù)篩實驗。

將初篩得到的20株米曲霉菌株接種到制曲培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度35 ℃、接種量1%(濃度為1×107個/mL)的條件下制曲62 h時分別檢測其氨肽酶的活性，結(jié)果見圖3。

圖3 復(fù)篩時氨肽酶在62 h的活性Fig.3 The aminopeptidase activity at 62 h during rescreening

由圖3可知，CICC2066氨肽酶活性為201.4 U/mL，在誘變處理后的菌株中，M5菌株氨肽酶的活性最大，達到246.3 U/mL，較出發(fā)菌株提高了1.21倍，其他誘變菌株中，比CICC2066氨肽酶活性高的菌株有M2、M3、M4、M5、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M16、M17、M18、M20、M21，比CICC2066氨肽酶活性低的有M6、M7、M15、M19。在ARTP誘變的初次篩選中，選取的HE值均大于CICC2066，制曲培養(yǎng)結(jié)果表明米曲霉產(chǎn)氨肽酶的穩(wěn)定性存在差異，造成氨肽酶活性降低的原因可能是在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)條件對米曲霉代謝能力產(chǎn)生影響，導(dǎo)致米曲霉產(chǎn)氨肽酶的活性發(fā)生變化，而M5菌落在初篩時HE值最大，制曲培養(yǎng)后氨肽酶活性也最大，說明M5菌株不僅產(chǎn)氨肽酶能力高，而且具有一定的產(chǎn)酶穩(wěn)定性。將M5菌株培養(yǎng)一段時間后，用凍存管收集其孢子并用20%的甘油于-80 ℃保存。

2.4 ARTP技術(shù)誘變后遺傳穩(wěn)定性檢測

生產(chǎn)菌種容易出現(xiàn)退化、連續(xù)傳代引起菌株產(chǎn)酶能力下降等問題，因此檢測菌種遺傳穩(wěn)定性很有必要。將M5菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，在溫度35 ℃、接種量1%(濃度為1×107個/mL)、制曲培養(yǎng)62 h的條件下檢測其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。

圖4 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性檢測Fig.4 The detection results of genetic stability of mutagenic strains

由圖4可知，第1代M5產(chǎn)氨肽酶活性為243.1 U/mL，第5代氨肽酶活性為245.3 U/mL，最高氨肽酶活性為249.3 U/mL。氨肽酶活性維持在241.2～249.3 U/mL，氨肽酶活性差異不大，表明M5菌株具有遺傳的穩(wěn)定性。

2.5 常壓室溫等離子誘變篩選的M5菌株與出發(fā)菌株CICC2066的對比

將M5菌株與CICC2066菌株在培養(yǎng)溫度為35 ℃、接種量為1%(濃度為1×107個/mL)的條件下接種到制曲培養(yǎng)基中，分別測定不同時間段的氨肽酶活性，檢測結(jié)果見圖5。

圖5 不同時間段M5菌株與CICC2066菌株的氨肽酶活性Fig.5 The aminopeptidase activity of M5 and CICC2066 strains at different time periods

由圖5可知，M5菌株在培養(yǎng)時間24～50 h內(nèi)氨肽酶活性上升平緩，在64 h時氨肽酶活性達到峰值，為246.1 U/mL，隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)上升，氨肽酶活性開始下降，在培養(yǎng)72 h時發(fā)酵結(jié)束，氨肽酶活性為220.3 U/mL。CICC2066菌株在培養(yǎng)時間24～42 h內(nèi)氨肽酶活性變化平緩，在42～62 h內(nèi)氨肽酶活性上升快，在60 h時氨肽酶活性達到峰值190.1 U/mL，隨后開始下降，在72 h發(fā)酵結(jié)束時氨肽酶活性為171.2 U/mL。

孢子指標(biāo)的檢測是考察米曲霉菌株優(yōu)良性的一項重要指標(biāo)，孢子的生長決定米曲霉長勢進而影響其代謝能力，在培養(yǎng)條件為時間62 h、培養(yǎng)溫度35 ℃、孢子液濃度1×107個/mL、PDA平板培養(yǎng)條件下對M5和CICC2066孢子的生長情況進行比較，結(jié)果見圖6。

圖6 CICC2066和M5的孢子掃描電鏡對比圖(250×)Fig.6 The scanning electron microscope comparison of spores of CICC2066 and M5(250×)

由圖6可知，M5菌株孢子直徑Δd=4.02 μm，CICC2066直徑Δd=3 μm，M5孢子直徑比CICC2066大1.02 μm，從外觀來看，經(jīng)ARTP技術(shù)處理后孢子生理形態(tài)發(fā)生變化，M5孢子中間較為凹陷，形狀多接近于橢球形，孢子生理形態(tài)的變化對米曲霉代謝能力是否存在關(guān)聯(lián)還需進一步研究。

在培養(yǎng)溫度為35 ℃，孢子液濃度為1×107個/mL，PDA平板培養(yǎng)62 h后，對M5菌株和CICC2066菌株的菌落生長狀況進行對比，見圖7。

圖7 CICC2066和M5的菌落生長對比圖Fig.7 The colony growth comparison of CICC2066 and M5

由圖7可知，在相同培養(yǎng)的條件下，M5菌株菌落更大，顏色為黃綠色，說明有大量孢子產(chǎn)生，菌落密集且連續(xù)，而同時期培養(yǎng)的CICC2066菌落較小，顏色多為白色，少數(shù)為黃綠色或者淺黃色，說明M5菌株生長更快，表明ARTP技術(shù)對米曲霉菌落生長速度產(chǎn)生影響。

在培養(yǎng)溫度為35 ℃，孢子接種量為1%(濃度為1×107個/mL)的條件下制曲培養(yǎng)62 h，對M5和CICC2066成曲進行比較，結(jié)果見圖8。由圖8可知，M5菌株所成的成曲較CICC2066蓬松，成曲顏色為黃綠色，表明有大量孢子產(chǎn)生，同時期CICC2066多為白色，少數(shù)成曲呈淡黃色，且CICC2066存在大量白色的菌絲體，表明M5比CICC2066生長更快，與平板培養(yǎng)結(jié)果一致。

圖8 CICC2066和M5成曲對比圖Fig.8 The comparison of CICC2066 and M5 finished kojis

3 結(jié)論

采用ARTP誘變技術(shù)，通過平板初篩、制曲復(fù)篩等方法成功篩選到一株氨肽酶酶活提高的米曲霉菌株，其氨肽酶活性比出發(fā)菌株CICC2066高1.21倍。將M5菌株傳代5次，其氨肽酶活性在241.2～249.3 U/mL，表明該菌株具有良好的遺傳性。M5在產(chǎn)酶能力上相比于CICC2066，在64 h時其酶活性達到峰值246.1 U/mL，比CICC2066酶活性峰值190.1 U/mL高出1.21倍，在72 h發(fā)酵結(jié)束后，其氨肽酶的活性仍比CICC2066高1.13倍，說明ARTP技術(shù)提高了CICC2066的產(chǎn)酶能力。經(jīng)掃描電鏡檢測，M5菌落的孢子直徑較CICC2066更大，且孢子生理形態(tài)發(fā)生變化，經(jīng)過PDA平板培養(yǎng)和制曲培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，M5較CICC2066在生長狀態(tài)上存在差異，表明孢子生理形態(tài)對菌落生長產(chǎn)生一定影響，但孢子生理形態(tài)的改變對產(chǎn)酶能力是否有影響還需進一步研究。