胡海權(quán)，張 斌

（1. 瑞金市人民醫(yī)院骨科，江西 瑞金 342500；2. 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330006）

椎間盤退行性變（Interver-tebral Disc Degeneration，IDD）是一種普遍但復(fù)雜的脊柱疾病，患病率極高，給患者和家庭帶來嚴(yán)重影響，增加社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。IDD 發(fā)病目前認(rèn)為與細(xì)胞外基質(zhì)的丟失、正常椎間盤細(xì)胞改變、細(xì)胞代謝下降及炎癥因子的釋放相關(guān)［2］。miRNAs 在基因和蛋白表達(dá)的調(diào)控中起著重要作用，參與多種生理和病理過程，如增殖、侵襲、凋亡、衰老等。越來越多的研究顯示，miRNA 在髓核細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞、軟骨終板細(xì)胞的凋亡、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制仍不清楚［3］。椎間盤由周圍的纖維環(huán)、中間的髓核及上下軟骨終板組成。營養(yǎng)物質(zhì)通過軟骨終板選擇性進(jìn)入髓核，對其進(jìn)行營養(yǎng)供應(yīng)和代謝物質(zhì)交換。軟骨終板的退變在椎間盤退變過程中起著重要作用。本研究采用頸椎退變椎間盤和無退變椎間盤軟骨終板組織樣本，應(yīng)用基因芯片篩查表達(dá)差異的miRNA，探索其發(fā)生發(fā)展調(diào)控機(jī)制，為臨床上IDD防治提供新的方向和思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年2 月至2020 年5 月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科就診，依據(jù)臨床癥狀和體征及經(jīng)X 線片、CT 和MRI檢查確診為頸椎椎間盤退變行前路椎間盤切除術(shù)患者21例（退變組），男12例，女9 例，年齡46～73 歲，平均（61.6±5.6）歲；選擇外傷導(dǎo)致頸椎椎體爆裂性骨折、需行前路減壓椎間盤切除術(shù)的無椎間盤退變患者13例（對照組），男9 例，女4 例，年齡26～35 歲，平均（26.8±2.6）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患結(jié)核、腫瘤、糖尿病、遺傳代謝疾病以及先天性畸形患者；近3 個(gè)月進(jìn)行免疫抑制劑治療的患者。兩組患者均對治療知情及簽署同意書。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 miRNA測序 椎間盤軟骨終板組織送上海英拜生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行基因芯片分析，芯片采用Agilent human miRNA，Microarrays 21.0（ID：080558）。提取每個(gè)樣本的總RNA，經(jīng)NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific）定量并使用Agilent Bioanalyzer 2100 檢測RNA 完整性。RNA 質(zhì)檢合格后，參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫?？俁NA 經(jīng)過去磷酸化，變性，再進(jìn)一步用Cyanine-3-CTP（Cy3）標(biāo)記。標(biāo)記好的RNA 純化后和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）掃描得到原始圖像，進(jìn)行miRNA的生物信息學(xué)分析及靶基因預(yù)測。

1.2.2 miRNAs 的qRT-PCR 驗(yàn)證 取出椎間盤組織并解凍，Trizol（Invitrogen公司，美國）裂解組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)定PCR 反應(yīng)條件：90 ℃10 min，95 ℃12 s，60 ℃2 min，共45 個(gè)循環(huán)。用SYBR Green Mater Mix 試劑（ABI 公司，美國）檢測mRNA 水平，重復(fù)3 次。使用8500 Real-time PCR儀（ABI公司，美國），用ΔΔCT 法對qRT-PCR 結(jié)果進(jìn)行定量分析，ΔCT 值為目的mRNA CT 值與內(nèi)參mRNA CT 值的差值，ΔΔCT 為各退變組ΔCT 與空白正常組ΔCT 的差值，平均相對含量=2-ΔΔCT。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR相關(guān)引物序列

1.2.3 免疫組化法 椎間盤軟骨終板組織用4%多聚甲醛溶液固定48 h，常規(guī)石蠟切片。將切片常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸鹽修復(fù)液高壓修復(fù)50 min，3%H2O2甲醇避光孵育10 min，10%山羊血清37 ℃孵育40 min，加入兔抗eEF-2一抗（1∶100），于4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗37 ℃孵育35 min，DAB 顯色。待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)，蒸餾水終止顯色。蘇木素染色60 s，鹽酸乙醇分化1～2 s，脫水封片。采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計(jì)數(shù)。

1.2.4 Western blot 法 檢測組織細(xì)胞中AMPK、p-AMPK、eEF-2、GAPDH 蛋白表達(dá)。兩組組織裂解后，提取總蛋白，BCA 法檢測樣品蛋白含量，各組取40 μg 蛋白分別進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳進(jìn)行分離，100 V 電壓電泳約30 min，待Marker 條帶跑開后120 V 電壓繼續(xù)電泳約l h，90 V 下PVDF 膜半干轉(zhuǎn)60 min，5%脫脂牛奶/TBST 液封閉3 h，分別加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST清洗后加入羊抗兔二抗（1∶500），室溫孵育2 h，TBST 洗滌后加入發(fā)光液。圖像處理軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常組與退變組的椎間盤組織的病理改變

正常組椎間盤組織鏡檢顯示結(jié)構(gòu)清晰正常，富含髓核細(xì)胞、軟骨終板和富含蛋白多糖；退變組椎間盤組織鏡檢顯示結(jié)構(gòu)紊亂，圓形髓核細(xì)胞增加顯著，占40%～50%，呈現(xiàn)空泡變性和集群分布（圖1）。

圖1 正常組與退變組患者椎間盤病理改變（HE×100）

2.2 miRNAs數(shù)據(jù)分析結(jié)果

2.2.1 miRNA 基因芯片的差異表達(dá)分析 取3 例正常的椎間盤組織和3 例退行性變的椎間盤組織進(jìn)行基因芯片測序。在正常組和退變組中共計(jì)發(fā)現(xiàn)1 162 個(gè)miRNAs，而在正常組和退變組間共篩選出35 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中上調(diào)22 個(gè)，下調(diào)13 個(gè)（圖2A）。從聚類熱圖（圖2B）中可以看出，正常組與退變組的椎間盤組織具有相似的聚類情況和表達(dá)譜，正常組的N1、N2 和N3 中差異表達(dá)的基因具有相似的聚類情況，退變組的D1、D2 和D3 差異表達(dá)的基因也具有相似的聚類情況，可見兩組間的組織間差異不大，測序結(jié)果較好。

圖2 基因芯片鑒定正常組和退變組之間差異表達(dá)的miRNAs

2.2.2 差異表達(dá)的miRNAs 的靶基因分析結(jié)果基于miRNA變化值＞2或＜0.5且P＜0.01，篩選后進(jìn)一步驗(yàn)證。hsa-miR-143-5p，hsa-miR-222-5p，hsamiR-140-5p，hsa-miR-199a-5p 和hsa-miR-132 在正常組和退變組中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過qRTPCR 驗(yàn)證顯示，與正常對照組相比，退變組hsamiR-143-5p 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），hsamiR-222-5p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-199a-5p 和hsa-miR-132差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 qRT-PCR驗(yàn)證miRNAs的差異表達(dá)

2.3 免疫組化和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 WB 與免疫組化顯示退變組的eEF-2 蛋白含量顯著降低 采用WB 和免疫熒光法檢測eEF-2在正常組和退變組的蛋白表達(dá)變化。WB 結(jié)果顯示，與正常組相比，退變組的eEF-2 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，）（圖3）；免疫組化結(jié)果顯示eEF-2在退變組表達(dá)降低（圖4）。

圖3 WB顯示抑制AMPK下游eEF-2

圖4 免疫組化顯示抑制AMPK下游eEF-2（SP×400）

2.3.2 WB 檢測兩組p-AMPK、AMPK 表達(dá) 采用WB 方法檢測p-AMPK 和AMPK 在正常組和退變組的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與正常組相比，退變組的p-AMPK 表達(dá)增加（P＜0.01），AMPK 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5）。

圖5 WB檢測兩組p-AMPK和AMPK的表達(dá)

3 討 論

在椎間盤退變過程中，椎間盤組織發(fā)生了復(fù)雜的生物化學(xué)以及分子水平的改變。目前認(rèn)為椎間盤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、表觀遺傳和基因等是IDD 的風(fēng)險(xiǎn)因素［4］。我們的研究顯示，正常組的椎間盤髓核的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞與退變組有顯著差異，但其具體的機(jī)制不清楚。miRNA是由18～22個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，高度保守，大部分miRNA 通過與靶基因3與靶基區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，調(diào)控靶基因-蛋白質(zhì)的過程，從而達(dá)到在細(xì)胞、組織，甚至個(gè)體水平上影響機(jī)體的生理病理［5］。目前有研究顯示，miRNA與椎間盤退行性變密切相關(guān)［6］。多種miRNA 主要通過作用于細(xì)胞凋亡、炎癥信號反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)成分等環(huán)節(jié)參與影響IDD 的發(fā)生發(fā)展［7］。miR-143-5p 參與多項(xiàng)疾病的進(jìn)展，如細(xì)胞的分化、增殖、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解等［8］。KARIMI L 等［9］研究顯示，miR-143-5p 具有對肌肉分化和老化的作用；過表達(dá)miR-143-5p可導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞的遷移、增殖和黑色素的生成，沉默表達(dá)miR-143-5p有助于促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的分化。在IDD 中研究顯示，miR-143-5p可抑制髓核細(xì)胞的增殖、分化，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和衰老。目前也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-143-5p 在退行性變椎間盤中高表達(dá)，其通過負(fù)調(diào)控BCL-2促進(jìn)IDD 的進(jìn)展［10］。我們通過對退行性變的椎間盤組織進(jìn)行基因篩查發(fā)現(xiàn)，退行性變患者的椎間盤組織miRNA 發(fā)生了系列變化。在退行性變患者頸椎間盤組織細(xì)胞中篩選出35個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中22個(gè)表達(dá)上調(diào)，13個(gè)表達(dá)下調(diào)，隨后擴(kuò)大樣本量，運(yùn)用qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果，顯示hsa-miR-222-5p，hsa-miR-140-5p，hsamiR-199a-5p 和hsa-miR-132 表達(dá)水平無顯著差異，僅有hsa-miR-143-5p 表達(dá)顯著增加。因此，本研究選取miR-143-5p進(jìn)一步研究。

AMPK 是能量代謝的感受器，被稱為能量代謝的調(diào)節(jié)器，能協(xié)調(diào)細(xì)胞的合成代謝和分解代謝［11］。主要受到細(xì)胞內(nèi)的AMP/ATP 比例調(diào)控［12］。AMPK參與了眾多的生理病理過程，如缺氧、缺血、低糖等各種應(yīng)激反應(yīng)［13］。AMPK 在參與軟骨的形成和降解過程中發(fā)揮重要作用，與關(guān)節(jié)的活性和關(guān)節(jié)軟骨的退行性變密切相關(guān)。AMPK 參與細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)。YANG Q 等［14］對腰椎間盤的研究提示，發(fā)現(xiàn)AMPK 參與了腰椎間盤的退行性變。這與我們的研究較為一致。我們研究結(jié)果顯示，退行性變的椎間盤中p-AMPK 高表達(dá)。eEF-2 在調(diào)控蛋白合成中起著重要作用［15］。miR-143-5p 可以靶向調(diào)節(jié)eEF-2 基因。通過模擬miR-143-5p 物可以激活A(yù)MPK，提示miR-143-5p通過作用eEF-2調(diào)控AMPK，我們在椎間盤退行性變中發(fā)現(xiàn)p-AMPK增加，eEF-2表達(dá)降低。

綜上所述，miR-143-5p 在頸椎退行性變患者的椎間盤軟骨終板組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)量與椎間盤退變密切相關(guān)。同時(shí)，miR-143-5p 可能通過AMPK通路介導(dǎo)椎間盤退行性變。