劉 寧 陳 勤 伍耀宏 江西省贛州市人民醫(yī)院 341000

脊柱退行性疾病是骨科常見疾病，目前認(rèn)為椎間盤退變是這一系列脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)。嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于椎間盤的退變，椎間盤的生物力學(xué)發(fā)生了顯著變化，椎間盤間隙的高度降低，導(dǎo)致脊柱不穩(wěn)、椎間盤突出、脊髓或神經(jīng)根受壓，引起肢體疼痛、麻木等癥狀[1-3]。軟骨終板可以維持椎體的正常形態(tài)，防止髓核向相鄰椎體凸出，保護(hù)椎體在承受壓力時(shí)避免壓迫性骨萎縮。同時(shí)，軟骨終板能夠吸收來自脊柱負(fù)重的靜態(tài)壓力。軟骨終板作為椎間盤的主要營養(yǎng)途徑，通過滲透作用為椎間盤提供營養(yǎng)和體液交換[4]。目前，椎間盤干細(xì)胞已成為研究的焦點(diǎn)，軟骨終板中干細(xì)胞的存在引起了臨床研究者的關(guān)注[5]。細(xì)胞衰老是指細(xì)胞周期的阻滯，衰老相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)以及衰老相關(guān)通路的激活，如p53-p21、p16等，在機(jī)體變性中起著非常重要的作用。近年來的研究表明，干細(xì)胞的老化是組織變性或器官疾病的重要原因。研究證實(shí)了軟骨終板干細(xì)胞存在于人類椎間盤終板組織中[6]。然而，軟骨終板干細(xì)胞在衰老過程中的存在國內(nèi)外鮮有報(bào)道，其在椎間盤退變中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究將通過檢測(cè)不同年齡組獲得的人軟骨終板干細(xì)胞的增殖活性、周期停滯、細(xì)胞衰老等指標(biāo)來驗(yàn)證人軟骨終板干細(xì)胞的衰老現(xiàn)象。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集了本院2020年1—5月因腰椎間盤退變性疾病行腰椎間盤摘除術(shù)植骨融合的30例臨床標(biāo)本，女13例，男17例，年齡35～58歲，將其按不同年齡段分為高年齡組(≥46歲，n=16)和低年齡組(<46歲，n=14)。高齡組中男9例，女7例，平均年齡(51.69±4.09)歲；低齡組中男8例，女6例，平均年齡(40.64±3.77)歲。所有患者均行腰椎MRI等常規(guī)檢查判斷椎間盤退變程度，且既往無腰痛病史，本研究所需標(biāo)本均經(jīng)患者或家屬簽字同意, 并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及儀器 倒置顯微鏡(青島富堡精密儀器有限公司)、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(上海研生實(shí)業(yè)有限公司)、CCK-8 試劑盒(翌圣生物科技有限公司)、酶標(biāo)系統(tǒng)多功能儀(青島聚創(chuàng)環(huán)保有限公司)、流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司)、一次性培養(yǎng)皿(山東博科控股集團(tuán))、PBS緩沖液(東莞市斯巴達(dá)化學(xué)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 軟骨終板干細(xì)胞提取、培養(yǎng)：取軟骨終板，去除周圍纖維環(huán)、髓核和軟骨。清洗后，用PBS清洗。將部分組織放入玻璃皿中，加入透明質(zhì)酸酶和Ⅱ型膠原酶消化液。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后將消化塊加入培養(yǎng)基中，收集細(xì)胞懸浮液，離心10min，丟棄上清液，將細(xì)胞重新懸浮并在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.3.2 β-半乳糖苷酶染色法觀察細(xì)胞形態(tài)和衰老活性：培養(yǎng)孔板中的培養(yǎng)基清除，用 PBS清洗細(xì)胞2次，加入染色固定液，固定15min，PBS清洗3次，3min/次，加人工作液混勻后，滴加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，覆蓋所有的細(xì)胞，37℃孵箱孵育過夜，PBS清洗后，顯微鏡下觀察染色情況，記錄染色結(jié)果，采用 ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯情況：將中板軟骨細(xì)胞常規(guī)胰酶消化、收集、離心(1 000r，5min)；再用PBS緩沖液沖洗后再次離心5min，加入乙醇溶液后固定24h，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，最后分析計(jì)算結(jié)果。

1.3.4 CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性：為驗(yàn)證所分離出細(xì)胞的增殖能力，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的活力，向每個(gè)小孔內(nèi)滴加10μl CCK-8顯色溶液，然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。分別于12h、24h后，迅速在酶標(biāo)儀上檢測(cè)每組細(xì)胞的OD值。

2 結(jié)果

2.1 兩組椎間盤軟骨終板干細(xì)胞的形態(tài)比較 低年齡組椎間盤終板軟骨細(xì)胞呈圓形、多角形，形態(tài)較飽滿，高年齡組細(xì)胞形態(tài)明顯細(xì)長(zhǎng)、較扁，呈長(zhǎng)梭形改變，呈明顯的退變形態(tài)。見圖1。

圖1 各組軟骨終板干細(xì)胞的形態(tài)

2.2 兩組衰老細(xì)胞陽性比比較 高年齡組衰老細(xì)胞陽性比為(73.6±3.56)%，明顯高于低年齡組的(35.4±2.89)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.94，P<0.05)。

2.3 兩組細(xì)胞周期情況比較 高年齡組的G1期細(xì)胞比和(S+G2/M)期細(xì)胞比均低于低年齡組(P<0.05)。說明高年齡組的細(xì)胞周期阻滯情況較低年齡組更明顯。見表1。

表1 兩組細(xì)胞周期情況比較

2.4 兩組細(xì)胞的增殖活性比較 高年齡組的12hOD、24hOD均低于低年齡組(P<0.05)。說明高年齡組的軟骨干細(xì)胞增殖活性低于低年齡組。見表2

表2 兩組細(xì)胞OD值比較

3 討論

臨床上椎間盤退變導(dǎo)致的脊柱疾病很常見，正在不同程度地影響著70%以上的年輕人，致殘率較高，極大降低患者生活質(zhì)量[7]，目前，主要的治療策略是椎間盤切除術(shù)。近年來，椎間盤退變的細(xì)胞替代療法和組織工程已成為研究的熱點(diǎn)。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞作為細(xì)胞替代治療的理想種子細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，軟骨終板干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為椎間盤退行性細(xì)胞治療的種子細(xì)胞提供了新的選擇[8]。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致椎間盤退變的因素很多，如遺傳因素、機(jī)械負(fù)荷、炎癥因素等，但椎間盤退變的確切機(jī)制尚不清楚。目前有大量研究認(rèn)為細(xì)胞衰老與椎間盤退變有非常重要的關(guān)系，細(xì)胞衰老可能是椎間盤退變的重要影響因素[9-10]，特別是椎間盤的髓核和纖維環(huán)。β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞可見于退變椎間盤的髓核和纖維環(huán)中，β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量的減少和細(xì)胞的復(fù)制潛能與椎間盤的退變程度密切相關(guān)[11]。然而，尚未見椎間盤軟骨老化的報(bào)道。椎間盤的終板被認(rèn)為是椎間盤的營養(yǎng)通道。因此，椎間盤終板的退變和鈣化會(huì)降低其均勻傳遞的能力，阻礙NP營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散，誘發(fā)或加速椎間盤的退變。因此，探討椎間盤終板軟骨細(xì)胞的老化對(duì)椎間盤退變具有重要意義，可以更好地指導(dǎo)椎間盤退變的預(yù)防，使部分患者可以避免手術(shù)治療。

在本研究中，高年齡組細(xì)胞形態(tài)的退變程度要高于低年齡組，說明隨著年齡的增加，軟骨細(xì)胞的退變會(huì)更加明顯，在β-半乳糖苷酶染色法中，高年齡組衰老陽性細(xì)胞比明顯高于低年齡組；高年齡組細(xì)胞增值率低于低年齡組，而且周期阻滯強(qiáng)于低年齡組，以上研究結(jié)果表明，軟骨終板中干細(xì)胞的衰老現(xiàn)象是存在的，并且隨著年齡的增加軟骨細(xì)胞的代謝、增值率降低，這造成了軟骨細(xì)胞的數(shù)量減少，從而間接引起臨近細(xì)胞的凋亡。有學(xué)者指出，軟骨終板是作為椎間盤最重要的組成部分而存在，是維持其正常形態(tài)的重要因素，其退變過程是一個(gè)多因素的復(fù)雜過程，主要與年齡、局部炎癥因子、終板軟骨細(xì)胞功能等因素相關(guān)[4]。研究指出，軟骨終板細(xì)胞凋亡的增加,使單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞外基質(zhì)含量也下降,軟骨終板物理結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分及生物效應(yīng)發(fā)生變化,軟骨終板細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的有效膠體滲透壓不能穩(wěn)定維持,營養(yǎng)代謝紊亂,軟骨終板骨化,加快了終板組織變形,同時(shí)變形加快了細(xì)胞凋亡,形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致細(xì)胞密度顯著降低，并持續(xù)鈣化、骨化,脆性增加而出現(xiàn)裂隙和破壞[12]。這也與本文研究結(jié)果相一致。

綜上所述，椎間盤軟骨終板干細(xì)胞存在衰老現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)的退變、細(xì)胞周期改變、增殖能力下降等。且椎間盤軟骨終板干細(xì)胞的衰老現(xiàn)象會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而愈發(fā)明顯，這為椎間盤退變的預(yù)防提供了較好的指導(dǎo)，具有重要的臨床意義。