陳良妮，程雪梅，王 琳，高 武，陳 勇，王長虹*

[1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530000；3.國藥集團(tuán)精方(安徽)藥業(yè)股份有限公司，安徽 宣城 242000]

風(fēng)濕骨痛膠囊由制川烏、制草烏、甘草、麻黃、紅花、木瓜、烏梅制成的中藥復(fù)方制劑，具有溫經(jīng)散寒、通絡(luò)止痛的功效，用于寒濕閉阻經(jīng)絡(luò)所致的弊病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[1-4]。2015年版《中國藥典》對麻黃進(jìn)行了TLC鑒別、HPLC含量測定；對制川烏、制草烏進(jìn)行了TLC限量檢測及紫外分光光度法測定烏頭總生物堿。相關(guān)文獻(xiàn)利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對方中制川烏、制草烏的9個(gè)烏頭類生物堿做了定量研究[5]。

指紋圖譜是基于對中藥及中藥制劑物質(zhì)量群整體作用的認(rèn)識，通過中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，實(shí)現(xiàn)鑒別中藥及中藥制劑真實(shí)性，評價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性[6-9]。化學(xué)模式識別技術(shù)可以對具有模糊性和整體性的中藥指紋圖譜實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維、識別和分類，是篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物的重要數(shù)學(xué)方法，具有較高的預(yù)測精度和較強(qiáng)的線性數(shù)據(jù)分析分類等優(yōu)勢，如主成分分析(principalcomponent analysis，PCA)、偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminantanalysis，PLS-DA)、判別分析(discriminantanalysis，DA)、偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminantanalysis，PLS-DA)等，已廣泛應(yīng)用于指紋圖譜等多維數(shù)據(jù)的處理分析中[10-13]。目前，采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)評價(jià)不同批次風(fēng)濕骨痛膠囊的質(zhì)量穩(wěn)定性研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)分析評價(jià)風(fēng)濕骨痛膠囊的質(zhì)量穩(wěn)定性和批次一致性。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent G1315C DAD檢測器、Agilent Open Lab CDS 2.x化學(xué)工作站(美國Agilent公司)；AE200電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；SK1200H超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Milli-Q Intergral水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 磷酸、乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。鹽酸麻黃堿(批號171241-201809，純度>98%)、鹽酸偽麻黃堿(批號171237-201510，純度>98%)對照品購于中國食品藥品檢定研究院；苯甲酰新烏頭原堿(批號DST191023-056，純度>98%)、芹糖甘草苷(批號DST191102-139，純度>98%)對照品購于樂美天醫(yī)藥/德思特生物公司；綠原酸(批號AF7070309，純度>98%)、甘草素(批號AF8052202，純度>98%)對照品購于成都埃法生物科技有限公司；甘草苷(批號070003-201602，純度>98%)、異甘草苷(批號250026-201511，純度>98%)、甘草酸單銨(批號070020-201508，純度>98%)對照品購于上海奈啟生物科技有限公司。風(fēng)濕骨痛膠囊共20批，由國藥集團(tuán)精方(安徽)藥業(yè)股份有限公司提供，批號分別為180107、180201、180408、180501、180503、180504、180602、181206、190101、190103、190105、190106、190108、190302、190303、190304、190306、190307、190310。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm(0～20 min)、310 nm (20～36 min)、235 nm (36～60 min)；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 稱取各對照品適量，70%甲醇溶解，即得(質(zhì)量濃度分別為鹽酸麻黃堿134.6 μg/mL、鹽酸偽麻黃堿228.7 μg/mL、綠原酸18.30 μg/mL、苯甲酰新烏頭原堿45.30 μg/mL、芹糖甘草苷36.40 μg/mL、甘草苷117.9 μg/mL、異甘草苷31.50 μg/mL、甘草素17.80 μg/mL、甘草酸132.3 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.8 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，以甘草酸峰為參照，測得共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD分別在0～0.62%、0.12%～2.85%范圍內(nèi)，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批膠囊裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物，研細(xì)，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以甘草酸為參照，測得共有峰保留時(shí)間、相對峰面積RSD分別在0.01%～0.33%、0.28%～4.73%范圍內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批膠囊裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物，研細(xì)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，以甘草酸峰為參照，測得共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積RSD分別在0.01%～0.23%、0.12%～3.71%范圍內(nèi)，表明溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 相對保留時(shí)間、相對峰面積 20批樣品中共有峰相對保留時(shí)間RSD在0.01%～0.49%范圍內(nèi)，表明其相對穩(wěn)定；相對峰面積RSD在3.74%～71.78%范圍內(nèi)，表明其差異較大。

2.4 HPLC指紋圖譜建立

2.4.1 圖譜生成 取20批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.2 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行全峰匹配，共確定31個(gè)共有峰，見圖1。

圖1 20批樣品HPLC指紋圖譜

2.4.2 共有峰指認(rèn)和參照峰選擇 吸取“2.2”項(xiàng)下對照品、供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。通過文獻(xiàn)查閱，指認(rèn)出2號峰為原兒茶酸；通過DAD檢測器紫外吸收值比對，指認(rèn)4號峰為鹽酸麻黃堿，5號峰為鹽酸偽麻黃堿，8號峰為綠原酸，12號峰為芹糖甘草苷，13號峰為甘草苷，15號峰為苯甲酰新烏頭原堿，17號峰為異甘草苷，19號峰為甘草素，22號峰為甘草酸，再選擇與相鄰色譜峰分離效果良好、保留時(shí)間穩(wěn)定的22號峰(甘草酸)作為參照。

2.4.3 相似度分析 將20批樣品相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件，以對照圖譜為參照[14]，計(jì)算相似度，結(jié)果見表2。

4.鹽酸麻黃堿 5.鹽酸偽麻黃堿 8.綠原酸 12.芹糖甘草苷 13.甘草苷 15.苯甲酰新烏頭原堿 17.異甘草苷 19.甘草素 22.甘草酸圖2 對照品(A)、供試品(B)HPLC色譜圖

表2 20批樣品相似度

2.5 化學(xué)模式識別分析

2.5.1 主成分分析(PCA)將共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMICA13.0軟件，進(jìn)行無監(jiān)督的PCA分析[15]，結(jié)果見圖3。由此可知，20批樣品可分為2類，區(qū)分度較為明顯。

圖3 20批樣品PCA得分圖

2.5.2 偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)將共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA13.0軟件，在PCA分析的基礎(chǔ)上建立有監(jiān)督的PLS-DA判別分析，獲得PLS-DA得分圖、VIP圖、聚類分析圖，分別見圖4～6。由圖4可知，20批樣品可分為2個(gè)區(qū)域。由圖5可知，5號峰為偽麻黃堿，19號峰為甘草素，14號峰為麻黃堿，22號峰為甘草酸，15號峰為苯甲酰新烏頭原堿，13號峰為甘草苷，2號峰為原兒茶酸，貢獻(xiàn)值均大于1；11號峰是制川烏、制草烏、紅花、烏梅的共有峰，7號峰是木瓜、烏梅的共有峰，27、30號峰來自甘草，3號峰是制川烏、制草烏共有峰，6號峰來自紅花，均對分類有顯著影響，即為主要成分的質(zhì)量標(biāo)志物。由圖6可知，20批樣品可聚為2大類，與圖4一致。

圖4 共有峰PLS-DA得分圖

圖5 共有峰VIP圖

圖6 20批樣品聚類分析圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對樣品處理方法進(jìn)行考察，確定以70%甲醇超聲提取30 min制備供試品溶液。再對檢測波長進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)210 nm(0～20 min)、310 nm(20～36 min)、235 nm(36～60 min)的分段程序檢測效果最佳。

20批風(fēng)濕骨痛膠囊的HPLC指紋圖譜中確定31個(gè)共有峰，指認(rèn)出麻黃堿、甘草苷、苯甲酰新烏頭原堿等10種成分。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012版)軟件分析，結(jié)果相似度均大于0.95，說明風(fēng)濕骨痛膠囊質(zhì)量穩(wěn)定。但PCA、聚類分析和PLS-DA均將20批樣品明顯分成2類，結(jié)合化學(xué)模式識別方法結(jié)果，說明不同批次樣品共有峰存在一定的差異。調(diào)取生產(chǎn)批記錄分析發(fā)現(xiàn)，20批樣品中編號為1～8的采用不同批次的原料藥材，而編號為9～20的采用同一批次的原料藥材，指紋特征也具有更高的相似性，即該產(chǎn)品的制備工藝具有較高的穩(wěn)定性，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全吻合，說明原料差異對成品的影響是重要因素之一。為了保證生產(chǎn)過程批次間的一致性，應(yīng)加強(qiáng)對原料藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，并且對質(zhì)量合格的多個(gè)批次原料藥材進(jìn)行校兌后再投入生產(chǎn)也是可供選擇的策略之一。