顧詠梅，夏鑫慧，王宇婷，賈豐璘，姜廷波，周博如

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

楊樹是一種重要的木本植物，廣泛分布于溫帶和寒溫帶地區(qū)，是一種具有經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的工業(yè)原料來源，是我國北方重要的造林樹種，鹽堿化、寒冷、干旱等非生物脅迫是限制其生長發(fā)育的主要因素［1］。轉(zhuǎn)錄因子是植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)環(huán)境脅迫如干旱、鹽堿等的主要調(diào)節(jié)因子［2］。作為數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，MYB 轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于真核生物中［3］。隨著玉米中MYB 家族基因的首次發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)其研究日益深入?，F(xiàn)已從擬南芥、水稻、玉米、大豆等植物中鑒定出了多種MYB 家族的轉(zhuǎn)錄因子［4~7］。

由氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域是大多數(shù)的MYB 蛋白所共有的，根據(jù)其所含結(jié)構(gòu)域的數(shù)目的不同，可將其劃分為 4 個(gè)亞類［8］：1R-MYB；R2R3-MYB；3R-MYB 和 4R-MYB。R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子是MYB 家族中最大的亞家族，目前楊樹基因組中發(fā)現(xiàn)有192 個(gè)基因編碼R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子［9］。以往研究發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB 在調(diào)節(jié)植物的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝、植物生長發(fā)育和細(xì)胞分化等生理過程以及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)中起著重要的作用［10~12］。在擬南芥中AtMYB96基因可增強(qiáng)植株的抗旱和抗病能力，干旱條件下該基因促進(jìn)植株表皮合成蠟質(zhì)并參與水楊酸和脫落酸介導(dǎo)的抗病信號(hào)傳遞［13］。MYB6在楊樹中能正調(diào)控單寧和花青素的合成，同時(shí)抑制木質(zhì)素的代謝通路［14］。PagMYB73在鹽和滲透脅迫條件下，在不同組織中均顯示出前期表達(dá)水平逐漸提高、隨后漸漸恢復(fù)的表達(dá)模式，且PagMYB73基因可以提高鹽脅迫條件下植物清除活性氧能力和脯氨酸積累，增強(qiáng)其耐鹽脅迫能力［15］。本研究對(duì)小黑楊MYB32的基因和氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，明確了該基因的理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，克隆并鑒定了該基因上游的啟動(dòng)子序列，預(yù)測了其順式作用元件的種類信息，探究了該基因應(yīng)答非生物脅迫的表達(dá)特點(diǎn)，為探明其生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)，為后續(xù)楊樹抗逆性和木材性狀的育種改良奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為本實(shí)驗(yàn)室培育的小黑楊（Populus simonii×P. nigra）雙單倍體的無性系，將生長周期為1 個(gè)月且長勢(shì)相近的小黑楊組培苗整理干凈后，置于相對(duì)濕度60%~70%、光周期16 h 光/8 h暗、平均溫度25 ℃條件下，在水中繼續(xù)培養(yǎng)15 d 左右，用 150 mmol·L-1NaCl 溶液處理（高鹽脅迫處理組均包含3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)），分析在鹽脅迫下MYB32基因的相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的克隆

使用CTAB 方法提取實(shí)驗(yàn)室野生型小黑楊的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA；在網(wǎng)站Phytozome（https：//phytozome. jgi. doe. gov/jbrowse/index.html）查找毛果楊中MYB32基因的序列，并設(shè)計(jì)引物 MYB32F、MYB32R（表 1），以上述 cDNA 為模板擴(kuò)增目的序列。通過CTAB 方法提取小黑楊的DNA，調(diào)取毛果楊中MYB32基因上游約2000 bp 的啟動(dòng)子序列，根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)引物QDZMYB32F、QDZ-MYB32R，以小黑楊的 DNA 為模板擴(kuò)增目的序列。分別獲得目的條帶后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到膠回收產(chǎn)物，將其分別與載體pMD19-T Vector 連接后，對(duì)連接產(chǎn)物利用大腸桿菌熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過藍(lán)白斑篩選，確定陽性克隆菌落，經(jīng)PCR 驗(yàn)證后送公司測序。

表1 MYB32 基因引物Table 1 Primers for MYB32 gene

1.2.2MYB32基因及啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

在線軟件 NewPLACE（https：//www.dna.affrc. go. jp/PLACE/？ action=newplace） 預(yù) 測MYB32基因啟動(dòng)子序列中的順式作用元件。

利用在線軟件Bioxm 查找MYB32的開放閱讀框（ORF）；利用 ExPASy（http：//web. expasy.org/cgi-bin/protparam/）分析氨基酸的理化性質(zhì)［16］；使 用 ProtScale（https：//web. expasy. org/protscale/）中 的 Kyte and Doolittle 算 法 分 析MYB32蛋白的是否親水；使用SignalP 5.0（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）對(duì)MYB32的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測；利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www. cbs. dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測MYB32蛋白是否具有跨膜結(jié)構(gòu)域。通過SOMPA（https：//npsaprabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？ page=npsa_sopma. html）在線分析MYB32蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在線預(yù)測軟件Swissmode（https：//swissmodel. expasy. org/interactive）預(yù) 測MYB32蛋 白的三級(jí)結(jié)構(gòu)［17］。在線預(yù)測軟件 Yloc（http：//abi.inf. uni-tuebingen. de/Services/YLoc/webloc. cgi）預(yù)測MYB32蛋白表達(dá)位置［18］。

NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 中 Blast（https：//blast. ncbi.nlm. nih. gov/Blast. cgi？ PROGRAM=blastp）查找與MYB32編碼氨基酸同源的序列，在不同物種中挑出9 條同源性較高的序列，并利用MEGAX中Neighbor-Joining Tree 建法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用BioEdit 軟件輸入上述10 條氨基酸保守序列進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.3 基因時(shí)空表達(dá)的分析

取四周齡的小黑楊組培苗，于相對(duì)濕度60%~70%、光照15 h/暗處理9 h、溫度25 ℃左右的條件下，繼續(xù)水培15 d。用150 mmol·L-1NaCl處理 0、3、6、12、24、48 h（每個(gè)處理均包含 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)）［18，19］，將樣本的根、莖、葉經(jīng)液氮處理后?80 ℃保存。

使用CTAB 法分別提取樣本RNA 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)MYB32基因的序列信息，在非保守結(jié)構(gòu)域處設(shè)計(jì)熒光定量引物QPCR-MYB32F、QPCR-MYB32R，以 Action 為內(nèi)參引物（表 1），使用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System進(jìn) 行 熒 光 定 量 PCR，其 結(jié) 果 利 用 2-ΔΔCt算 法 進(jìn) 行計(jì)算［20］。

1.2.4 亞細(xì)胞定位檢測

根據(jù)MYB32的序列信息，設(shè)計(jì)含有SpeI 酶切位點(diǎn)的酶切引物（表1）。將pMD19-T-MYB32 質(zhì)粒引入酶切位點(diǎn)，將PBI121-GFP 載體質(zhì)粒于37℃條件下用限制性內(nèi)切酶SpeI 進(jìn)行酶切。將載體酶切產(chǎn)物與加入酶切位點(diǎn)的基因產(chǎn)物，于50 ℃條件下用InFusion 連接酶反應(yīng)30 min，將其通過熱激法轉(zhuǎn)化，得到目的質(zhì)粒PBI21-MYB22-GFP。將重組質(zhì)粒和PBI121-GFP 空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 中，將含有重組表達(dá)載體和空載的農(nóng)桿菌，經(jīng)處理后分別注射到3 周齡的健康本氏煙草葉片中，在溫度25 ℃、空氣濕度為70%的條件下繼續(xù)暗培養(yǎng)48 h。將已注射的煙草葉片制片后在激光共聚焦顯微鏡下鏡檢，觀察葉片表皮細(xì)胞［21］。

1.2.5 酵母自激活活性驗(yàn)證

將MYB32基因兩分別端引入SalI 和NdeI 酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物（表2），并將MYB32基因編碼區(qū)進(jìn)行不同區(qū)域的分段研究，按照編碼的氨基酸區(qū)域共拆分為6 個(gè)區(qū)段，分別構(gòu)建到pGBKT7 載體上。將加入酶切位點(diǎn)的基因膠回收產(chǎn)物與pGBKT7 質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，挑選正確的陽性克隆。提取pGBKT7-MYB32質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入到酵母感受態(tài)細(xì)胞中。先將其涂布于SD/-Trp 篩選培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下培養(yǎng)3~5 d，挑取單菌落驗(yàn)證后，將菌液點(diǎn)涂于加入X-α-Gal 的 SD/-Trp/-His 培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)數(shù)天，觀察菌落是否有顏色變化。

表2 酵母自激活區(qū)域分段引物Table 2 Primers for self-activating regions of yeast

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差；運(yùn)用T-Test 函數(shù)進(jìn)行差異顯著性方差分析，統(tǒng)計(jì)各組之間在0.01 和0.05 水平的差異顯著性；使用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYB32 基因及其啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析

以小黑楊的cDNA 為模板，克隆MYB32基因的編碼序列。以小黑楊的DNA 為模板經(jīng)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增克隆出MYB32基因上游1 500 bp 的啟動(dòng)子序列。NewPLACE 預(yù)測后，得知MYB32基因的啟動(dòng)子序列中除去核心啟動(dòng)子元件外，還包含其它脅迫應(yīng)答元件（表3），涉及到赤霉素應(yīng)答元件P-box，ABA 應(yīng)答元件G-box，與干旱相關(guān)元件E-box、MYB-core 等（圖 1），說明MYB32基因在植物應(yīng)答各種脅迫過程中可能發(fā)揮重要作用［20］。

表3 MYB32 啟動(dòng)子克隆序列分析Table 3 Cloning sequence analysis of MYB32 promoter

圖1 MYB32 啟動(dòng)子響應(yīng)非生物脅迫（干旱、鹽、ABA 脅迫）的順式作用元件分布示意圖Fig.1 Schematic diagram of cis-acting elements of MYB32 promoter in response to abiotic stress（drought，salt andABA stress）

2.1.1 理化性質(zhì)分析

MYB32基因的 CDS 區(qū)全長 864 bp，使用 Ex-PASy ProtParam 預(yù)測分析，MYB32編碼蛋白大小287 aa，其分子式為C1436H2225N397O450S14，相對(duì)分子質(zhì)量32.699 69 ku，理論等電點(diǎn)5.85。根據(jù)其氨基組成得知，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)為38，帶正電荷殘基總數(shù)為31；該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為63.63，為不穩(wěn)定蛋白；親水性氨基酸數(shù)共134，占比約46.7%，疏水性氨基酸數(shù)共153，占比約53.3%，該蛋白的脂溶指數(shù)是70.31，平均親水性系數(shù)GRAVY 為?0.688，小于0，認(rèn)為該蛋白為親水蛋白（圖2A）。

2.1.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

使用Signal P 5.0 預(yù)測可知，該蛋白不包含信號(hào)肽；TMHMM 分析結(jié)果表明，該蛋白不包含跨膜結(jié)構(gòu)域 ；SOPMA 顯示該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由29.27%的α-螺旋、4.18%的β-折疊、64.11%的隨機(jī)卷曲和2.44% 的延伸帶所構(gòu)成（圖2C）。Swissmode 分析建模預(yù)測MYB32蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2B）。

圖2 MYB32 蛋白分析Fig.2 MYB32 protein analysis

2.1.3MYB32家族成員同源性關(guān)系分析

經(jīng)BLAST 比對(duì)后，挑選了9 個(gè)與該基因同源關(guān)系較近的物種，輸入MEGAX 軟件對(duì)MYB32氨基酸序列與其比對(duì)（圖3A），用Neighbor-Joining（NJ）鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3B）結(jié)果顯示，MYB32與毛果楊（Populus trichocarpa），簸箕柳（Salix suchowensis），銀白楊（Populus alba）一類親緣關(guān)系較近。與白櫟（Quercus lobata），楊梅（Mo?rella rubra），橡膠（Hevea brasiliensis），木薯（Mani?hot esculenta），藍(lán)果樹（Nyssa sinensis），麻瘋樹（Jat?ropha curcas）等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。BLAST 比對(duì)顯示該基因同毛果楊親緣關(guān)系最近達(dá)到97.21%。

圖3 MYB32 家族成員同源性關(guān)系分析Fig.3 Homology analysis of MYB32 family members

2.2 MYB32 應(yīng)答鹽脅迫差異表達(dá)

在水培條件下，MYB32基因在根莖葉中的表達(dá)量無明顯差異，而在150 mmol·L-1NaCl 的脅迫下該基因在不同時(shí)間點(diǎn)均明顯上調(diào)表達(dá)，并具有組織特異性。在150 mmol·L-1NaCl 脅迫下，根莖葉的表達(dá)量變化均符合先升高再降低的趨勢(shì)。其中根和莖的表達(dá)量均在脅迫的12 h 達(dá)到最大值，分別較對(duì)照升高了約11.4、4.8 倍。葉對(duì)鹽脅迫不敏感，在6 h 時(shí)表達(dá)量約為對(duì)照組的2.4 倍（圖4）。

圖4 小黑楊MYB32 基因鹽脅迫下不同組織在不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量變化Fig.4 Changes of MYB32 gene expression in different tissues under salt stress at different times

2.3 亞細(xì)胞定位分析

將攜帶空載和重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液經(jīng)處理后注入健康的煙草葉片后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到熒光反應(yīng)的位置（圖5）。經(jīng)驗(yàn)證MYB32蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)，與網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果一致。

圖5 MYB32 的亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.5 Subcellular localization of MYB32

2.4 酵母自激活活性驗(yàn)證

重組質(zhì)粒MYB32-pGBKT7 轉(zhuǎn)入到Y(jié)2H 酵母感受態(tài)細(xì)胞后，可在SD/-Trp 培養(yǎng)基中生長，且在加入了 X-α-Gal 的 SD/-Trp/-His 培養(yǎng)基中變藍(lán)，說明MYB32基因具有自激活活性。后續(xù)將MYB32基因分為6 個(gè)片段，最終確定轉(zhuǎn)錄自激活的結(jié)構(gòu)域?yàn)榭拷麮 端的片段（圖6）。隨著分段的縮小，發(fā)現(xiàn)第205~242 個(gè)氨基酸片段間，酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化后可以在加入了X-α-Gal 的SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上生長并發(fā)生顏色變化，而片段205~234 aa 在 SD/-Trp/-His/X-α-Gal 培養(yǎng)基不變藍(lán)，這說明MYB32轉(zhuǎn)錄因子的自激活結(jié)構(gòu)域在其蛋白的第205~242 位氨基酸之間。

圖6 MYB32 自激活區(qū)域Fig.6 MYB32 auto-activation region

3 討論

高等植物在不同水平上進(jìn)化出了各種機(jī)制來適應(yīng)多變的環(huán)境，包括脅迫信號(hào)傳感和轉(zhuǎn)導(dǎo)、特定轉(zhuǎn)錄因子的激活和相關(guān)基因的表達(dá)［22］。轉(zhuǎn)錄因子作為適應(yīng)應(yīng)激過程的重要組成部分，由不同的信號(hào)激活，負(fù)責(zé)應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)表明，MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族在應(yīng)對(duì)非生物脅迫（如干旱、低溫、高鹽及紫外輻射等）時(shí)，會(huì)發(fā)生特異性的表達(dá)變化。這說明它們?cè)趹?yīng)對(duì)極端條件中發(fā)揮重要作用。

MYB 基因在植物譜系中的進(jìn)化較為保守［23］，MYB 類轉(zhuǎn)錄因子具有1~4 個(gè)重復(fù)單元構(gòu)成的MYB 結(jié)構(gòu)域，MYB 的每個(gè)重復(fù)單元內(nèi)部有 3 個(gè) α-螺旋，第2 和第3 個(gè)螺旋構(gòu)建成一個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）的三維結(jié)構(gòu)［24］。在酵母自激活試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)MYB32基因可以在篩選培養(yǎng)基SD/-Trp/-His/X-α-Gal 上生長且菌落為藍(lán)色，證明了該基因具有自激活活性。試驗(yàn)中找到的具有自激活活性的最短片段，為后續(xù)酵母相關(guān)試驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。對(duì)MYB32基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域、不具備信號(hào)肽，是一種不穩(wěn)定的親水蛋白。對(duì)其上游啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測分析后，發(fā)現(xiàn)該基因除去含有核心啟動(dòng)元件外，還涉及光脅迫應(yīng)答元件、ABA 應(yīng)答脅迫元件、赤霉素應(yīng)答元件等多種脅迫應(yīng)答元件。這說明該基因在植物應(yīng)答各種脅迫過程中可能發(fā)揮了重要作用，參與了多種應(yīng)答反應(yīng)。在亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中表達(dá)，對(duì)后續(xù)基因功能、蛋白互作等研究提供基礎(chǔ)。

MYB-TFs 分布廣泛，是轉(zhuǎn)錄因子家族中含量最高、功能最強(qiáng)的一種，尤其R2R3-MYB 亞家族，在植物應(yīng)答非生物脅迫的調(diào)控過程起了關(guān)鍵作用［5，22，25］。在小麥中TaMYB33、TaMYB19和Ta?MYB73參與鹽脅迫反應(yīng)，在擬南芥中的過度表達(dá)顯著增強(qiáng)了它們對(duì)鹽脅迫的耐受性［26］。Ta?ODORANT1是一個(gè) R2R3-MYB 基因，在煙草中TaODORANT1過表達(dá)通過提高RWC、減少水分流失、降低 H2O2、MDA 和 Na+積累，增強(qiáng)了煙草的耐旱和耐鹽性［22］。擬南芥中GmMYB12B2的過度表達(dá)提高了對(duì)鹽和紫外線輻射脅迫的耐受性［27］。在水稻中，R2R3-MYB 型基因OsMYB91被證實(shí)與植物耐鹽性和植物生長有關(guān)［28］，但關(guān)于楊樹R2R3-MYB 基因應(yīng)答鹽脅迫的研究報(bào)道略顯單薄。本研究中通過高濃度的鹽脅迫證實(shí)了MYB32基因與抗逆相關(guān)，在高鹽脅迫下其相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在不同組織中其相對(duì)表達(dá)量不盡相同，具有明顯的組織特異性。

4 結(jié)論

本研究以小黑楊為研究對(duì)象，成功從小黑楊cDNA 中克隆出長度 864 bp 的MYB32基因，并由理化性質(zhì)分析、進(jìn)化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)研究等方面入手，研究了MYB32基因組織差異表達(dá)和對(duì)耐鹽度的差異表達(dá)。結(jié)果顯示鹽脅迫下MYB32具有明顯的組織特異性，根中表達(dá)量顯著高于莖葉。推測該基因與植物滲透調(diào)節(jié)相關(guān)，參與植物抗逆脅迫，為基因克隆、轉(zhuǎn)基因和后續(xù)研究生物學(xué)機(jī)制的奠定了基礎(chǔ)。