楊 碩，孫美玲，張 荳，宋肖樺，劉 鵬，李 飛，胡慧華*

0 引言

附子為毛莨科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，辛、甘，有大毒，歸心、腎、脾經(jīng)，具有回陽救逆，補(bǔ)火助陽，散寒止痛功效[1]。川烏為其干燥母根，辛、苦，熱，有大毒，歸心、肝、腎、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛之功[1]。

張仲景最善廣泛使用附子、烏頭，《傷寒雜病論》[2]中含有附子的方有20首，《金匱要略》[3]中含有附子的方有13首，大多用于治療少陰相關(guān)病證，起到鼓舞陽氣、補(bǔ)火助陽、散寒止痛、通痹利水等作用，如：四逆湯、附子湯、真武湯、麻黃附子湯。經(jīng)查閱《傷寒雜病論》《李濂醫(yī)史》《歷代名醫(yī)蒙求》《南陽人物志·古琴記》等相關(guān)文獻(xiàn)可知張仲景為今河南省南陽市人，其采藥以及使用的附子應(yīng)該來自南陽附近的山上，前期課題組實(shí)地探訪南陽市的張仲景祠，也認(rèn)為其使用的附子可能為南陽附近的野生附子[2-6]?，F(xiàn)在使用的附子大多來源為栽培品種，尤以四川江油產(chǎn)量最大、質(zhì)量最佳，是公認(rèn)的道地栽培區(qū)[7]。

經(jīng)對《傷寒論》《金匱要略》中附子、烏頭用量進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)張仲景使用附子、烏頭是以枚為計量單位，現(xiàn)在附子、烏頭均使用的是栽培品，完全仿照張仲景方中的附子、烏頭以枚為劑量單位已經(jīng)不適用了，因此，無法參照《傷寒論》、《金匱要略》中計量和現(xiàn)在的計量進(jìn)行對等換算，對于如何在臨床上正確掌握附子、烏頭的用量是一個很重要的問題，因此，本實(shí)驗(yàn)通過測定張仲景使用的南陽附子、烏頭和現(xiàn)今使用的江油附子、生川烏生物堿和多糖的含量，為研究張仲景使用的南陽附子、烏頭和現(xiàn)今使用的江油栽培附子、生川烏的差異提供依據(jù)，從而進(jìn)一步探究栽培品與野生品的用量，指導(dǎo)臨床用藥。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SB25-12 DTD型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Waters2498 Waters高效液相(DAD 檢測器、自動進(jìn)樣器、在線脫氣、四元泵)；BT125D型十萬分之一分析天平(Sartorius)；PH902-Ad110型pH計(泰州市正大科教儀器設(shè)備廠)；18系列紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 試劑 對照品新烏頭堿(批號：110798-201106)、烏頭堿(批號：110720-201111)、次烏頭堿(批號：110799-201106)、苯甲酰新烏頭原堿(批號：111795-201002)、苯甲酰烏頭原堿(批號：111794-201102)、苯甲酰次烏頭原堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號：111796-201002)購于中國食品藥品檢定研究院；D(+)無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，20160913)；氨水(批號：20160105)、異丙醇(批號：20150408)、乙酸乙酯(批號：20150818)、二氯甲烷(批號：20170320)、乙酸銨(批號：20150511)、三氯甲烷(批號：20160511)；蒽酮(批號：20161208)、濃硫酸(批號：20171028)、無水乙醇(批號：20161028)、丙酮(批號：20161002)、三氟乙酸(批號：20160128)購于北京化工廠；乙腈(批號：155758)、四氫呋喃(批號：163142)購于Fisher；冰醋酸(批號：20141018，天津市光復(fù)儀器廠)。

1.3 藥物 江油生附片(江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，批號分別為20140701、20150701、20160701)；江油生川烏(江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，批號分別為20150912、20160901、20150901)；南陽生附子、烏頭(2016年10月采于河南南陽，凈制)，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥所張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根及母根。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SAS 9.30軟件，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 生物堿含量的測定

2.1.1 色譜條件 采用《中華人民共和國藥典》法，Eclipse-C18為色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動相A，以0.1 mol/L醋酸銨(每1 000 ml含冰醋酸0.5 ml)為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 ml/min；檢測波長235 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl[1]。流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

2.1.2 對照品溶液的制備 取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對照品各1.89 mg、0.86 mg、0.36 mg、4.52 mg、6.01 mg、1.38 mg，精密稱定，加異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，即得。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 ml、1 ml、0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml、0.05 ml制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 采用《中華人民共和國藥典》法，取南陽野生附子、烏頭和江油栽培附子、生川烏每個樣品各2份，適量，粉碎，過三號篩，各取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入氨試液3 ml，再精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 ml，稱定重量，超聲處理(功率400 W，頻率40 kHz，水溫在25 ℃以下)30 min，放至室溫，再稱定重量，加異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補(bǔ)足減失重量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 ml，40 ℃以下回收溶劑至干，精密加入異丙醇-二氯甲烷(1∶1)3 ml溶解殘渣，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試液[1]。

2.1.4 含量測定 分別吸取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液10 μl，注入高效液相中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表2)，分別吸取每個供試品的溶液10 μl連續(xù)進(jìn)樣2次注入高效液相中，計算含量(表3、表4)。

表2 6種生物堿對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 附子、生川烏、烏頭中6種酯型生物堿的含量平均值(n=4,g/g)

表4 附子、生川烏、烏頭中單、雙酯和總酯型生物堿含量的平均值(n=4,g/g)

2.2 多糖含量的測定

2.2.1 供試品溶液的制備 取南陽野生附子、烏頭和江油栽培附子、生川烏各精密稱取1 g。加入10 ml 95%乙醇水回流提取2次，每次2 h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，加入40 ml純水于90 ℃恒溫水浴鍋中浸提2次，每次2 h，濾過，濾液濃縮至一定體積，加95%乙醇水使含醇量為80%，4 ℃冰箱中靜置48 h，沉淀依次用乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌2次，得粗多糖，將粗多糖溶于水，加水定容至250 ml，作為供試品溶液[8]。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密吸取濃度為 0.019 8 mg/ml葡萄糖對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，分別置于6支干燥的具塞刻度試管中，各加純水補(bǔ)至2.0 ml，緩緩加入新鮮配制的0.2%硫酸-蒽酮試劑8.0 ml，搖勻，沸水浴10 min，取出，冰水浴冷卻，放置10 min，以相應(yīng)試劑為空白，于592 nm處測定吸光度，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 y=147.490 1 x-0.037 22，r=0.999 1。結(jié)果表明，葡萄糖在0.001 98～0.019 8 mg/ml內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 最大吸光度的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 見圖1、圖2。

圖1 最大吸光度的確定

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.3.2 精密度試驗(yàn) 取1.98 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定多糖含量，重復(fù)6次。計算多糖含量分別為0.849 0%、0.855 7%、0.855 8%、0.855 8%、0.849 0%、0.849 0%，結(jié)果顯示，RSD為0.62%，該方法精密度良好。

2.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取江油生川烏0.48 g，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作制備6份供試品溶液,按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定多糖含量。計算多糖含量分別為3.513 6%、3.506 8%、3.506 8%、3.513 5%、3.506 8%、3.506 8%，結(jié)果顯示，RSD為0.11%，該方法重復(fù)性良好。

2.2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取南陽生附子0.46 g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定多糖含量，每4 小時測定1次，計算多糖含量分別為3.398 3%、3.384 8%、3.242 4%、3.357 6%、3.439 0%、3.506 8%，結(jié)果顯示，RSD為2.29%，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 附子多糖含量測定 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下各供試品溶液1 ml于具塞試管中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法顯色并測定吸光度，計算多糖含量(見表5)。

表5 附子、生川烏、烏頭的多糖含量(g/g)

3 討論

通過表4對比發(fā)現(xiàn)，南陽野生附子和烏頭的單酯、雙酯和總酯型生物堿顯著均高于江油栽培附子和生川烏。雙酯型生物堿含量上，江油附子和生川烏相差3倍，南陽附子和烏頭相差6倍，這或許是張仲景在臨床上區(qū)分使用附子和烏頭發(fā)揮不同功效的原因。通過表5對比發(fā)現(xiàn)，南陽野生附子多糖含量與江油栽培附子差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是江油生川烏(栽培烏頭)多糖含量顯著高于南陽野生烏頭。附子、生川烏、烏頭的多糖含量高低依次是：江油生川烏>江油生附片>南陽生附子>南陽烏頭。

生物堿和多糖均為附子的有效成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保護(hù)心肌缺血、降低膽固醇、強(qiáng)心、抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用[9-10]，研究顯示，現(xiàn)今使用的江油栽培附子、生川烏和張仲景使用的南陽野生附子、烏頭均含有6種單、雙酯型生物堿和多糖，只是在生物堿和多糖的含量上相差很大，說明其在療效方面存在強(qiáng)弱之分。

現(xiàn)今臨床均是以栽培品代替野生品來配付張仲景經(jīng)方顯然是可行的，但在使用中要多總結(jié)栽培品的療效滿意度，確定一個合適的使用量，而不是完全按照經(jīng)方的劑量使用，這樣既可以保證經(jīng)方的繼續(xù)使用，也可以保證栽培烏頭和附子的事業(yè)持續(xù)發(fā)展。因此，還需要進(jìn)一步加強(qiáng)對栽培品和野生品的差異性研究，從而指導(dǎo)臨床用藥。