吳玉峰， 劉雙平， 韓 笑， 應維茂， 毛 健,*

(1.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室/食品學院， 江蘇 無錫 214122；2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司 國家黃酒工程技術研究中心， 浙江 紹興 312000;3.江南大學(紹興)產(chǎn)業(yè)技術研究院， 浙江 紹興 312000)

紅曲黃酒是我國黃酒產(chǎn)業(yè)中獨樹一幟的一脈，因添加了紅曲作為發(fā)酵劑而具有與眾不同的生理活性功能。紅曲是以大米為主要原料，經(jīng)紅曲菌發(fā)酵而成的一種獨特的酒曲，富含天然紅色色素，古時又被稱為“丹曲”、“赤曲”等，具有藥用保健價值[1]。紅曲菌在發(fā)酵制曲過程中，產(chǎn)生了多種功能成分，如降脂活性物質(zhì)洛伐他汀、食品著色劑紅曲色素等[2]，其中洛伐他汀(lovastatin，又名Monacolin K)，由于具有顯著的降脂功效，備受國內(nèi)外學者的重視[3]。將紅曲應用于黃酒釀造，賦予了紅曲黃酒特有的降脂保健功能及天然棕紅色澤。因此紅曲的發(fā)酵制備是紅曲黃酒釀造必不可少的環(huán)節(jié)，紅曲質(zhì)量的好壞直接影響紅曲黃酒的品質(zhì)。

國家食品藥品監(jiān)督管理局的國食藥監(jiān)許[2010] 2號文件中規(guī)定，紅曲產(chǎn)品中洛伐他汀應當來源于紅曲，在紅曲黃酒發(fā)酵過程中洛伐他汀幾乎不被合成，只能由含洛伐他汀的釀酒原料——紅曲帶入到發(fā)酵醪中[4]。因此，紅曲中洛伐他汀含量的高低直接影響紅曲黃酒中的洛伐他汀含量，而紅曲中洛伐他汀含量取決于紅曲菌產(chǎn)洛伐他汀能力。盡管近年來國內(nèi)外對高產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌株的選育已開展了大量研究[5-7]，然而紅曲中洛伐他汀的含量仍然較低，且針對其在紅曲黃酒等酒類中的應用研究相對較少。紅曲菌的某些菌株會產(chǎn)生毒性物質(zhì)——桔霉素，使得紅曲的應用受到了限制[8]，也導致了紅曲黃酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展比較緩慢。由于不同種紅曲菌株代謝產(chǎn)洛伐他汀、紅曲色素、桔霉素含量及酶活的能力差異很大，目前國內(nèi)仍缺乏應用于釀酒行業(yè)的優(yōu)良菌種，因此篩選高產(chǎn)洛伐他汀、色素、酶及低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株對紅曲菌菌種資源的開發(fā)及其在黃酒中的應用具有重要意義。

我國紅曲的生產(chǎn)主要分布在福建、浙江、廣東等省份，故本研究對取自福建、浙江等地的紅曲樣品中的紅曲菌進行分離純化與固態(tài)發(fā)酵篩選，通過比較菌株發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀、紅曲色素、桔霉素含量以及糖化酶、液化酶、蛋白酶活力的差異，篩選出一株可應用于紅曲黃酒釀造的高產(chǎn)洛伐他汀的紅曲霉菌，并通過釀酒實驗驗證此紅曲菌株在實際生產(chǎn)中的發(fā)酵潛力，以期為傳統(tǒng)紅曲霉菌種資源的發(fā)掘利用以及對紅曲黃酒保健功能的提升奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從福建寧德、尤溪，浙江溫州、丹溪和廣東梅州等紅曲產(chǎn)地收集市售或農(nóng)家自制的紅曲樣品40份。

洛伐他汀、桔霉素標準品，阿拉丁試劑公司；2-辛醇、有機酸和氨基酸等標準品，Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純，百靈威科技有限公司；其他試劑為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

分離純化培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)，調(diào)節(jié)pH值至4.5～5.5。鑒定培養(yǎng)基為麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：取30 g秈米用乳酸調(diào)節(jié)pH值至5.0并浸泡2 h，轉(zhuǎn)入250 mL三角瓶，8層紗布封口后于121 ℃，0.08 MPa滅菌30 min，冷卻至室溫備用。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1CCV型超凈臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-1800型紫外可見光光度計，上海美普達儀器有限公司；DGG-9240B型干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；Waters e2695型高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters科技有限公司；Trace型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher公司；ProFlexTMBase型PCR儀，賽默飛科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1紅曲菌的分離純化

稱取適量紅曲樣品經(jīng)研缽研碎后，轉(zhuǎn)入至盛有適量無菌生理鹽水的帶玻璃珠三角瓶中，震蕩30 min后進行梯度稀釋，吸取0.1 mL稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)4～5 d，接種環(huán)挑取單菌落至新的分離平板上，純化出具有紅曲菌明顯特征的菌株[9]。

1.3.2高產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌株的篩選

將分離得到的紅曲菌株轉(zhuǎn)接至PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)7 d。待菌絲布滿斜面，試管背面為鮮紅色，用無菌水洗下斜面上的孢子，以每克(干質(zhì)量)大米接種106個孢子的比例接種于冷卻好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)48 h后搖散、攤平，此后每24 h搖瓶1～2次，直至14 d發(fā)酵結(jié)束，烘干備用[10]。采用HPLC法測定紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中的洛伐他汀含量，紫外分光光度法測定其色價，實驗重復3次取平均值。

1.3.3菌株鑒定

菌落形態(tài)觀察：采用3點接種法將菌株接種于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，肉眼觀察菌落的形態(tài)特征，包括菌落的大小、顏色、邊緣等。

菌株個體形態(tài)觀察：采用載片培養(yǎng)法在28 ℃下培養(yǎng)7 d，高倍顯微鏡(1 000倍)觀察菌體的個體形態(tài)。

分子生物學鑒定：參考文獻[11]提取紅曲菌H5-3的DNA，以紅曲菌總DNA為模版，分別利用引物對菌株的ITS基因序列(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和β-微管蛋白基因序列(Bt2a：5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’；Bt2b：5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’)進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增[12]。擴增產(chǎn)物送至上海生工公司進行測序。測序結(jié)果通過BLAST程序在美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行相似性比對，利用MEGA 7.0軟件進行多序列比對分析，通過Neighbor-Joining鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值設定為1 000次。

1.3.4紅曲指標的測定方法

洛伐他汀含量的測定：采用HPLC法，參考文獻[9]并稍作修改。

色價的測定：采用紫外分光光度計法，參照GB 1886.19—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 紅曲米》。

桔霉素含量的測定：采用HPLC法，參考QB/T 2847—2007《功能性紅曲米(粉)》并稍作修改。

糖化酶活力的測定：參照QB/T 5188—2017《釀造紅曲》。

液化酶活力的測定：參考文獻[13]方法并稍作修改進行檢測。

酸性蛋白酶活力的測定：參照QB/T 1803—93《工業(yè)酶制劑通用試驗方法》。

1.3.5紅曲黃酒的釀造

將秈米浸泡2 h后于121 ℃滅菌20～30 min，冷卻后接入紅曲菌孢子懸液，以每克(干質(zhì)量)大米接種106個孢子的比例接種，28 ℃靜置培養(yǎng)15 d左右，制成純紅曲米。參考文獻[14]中紅曲黃酒釀造工藝進行紅曲黃酒的制備，糯米經(jīng)浸米、蒸熟、冷卻后與黃酒酵母(質(zhì)量分數(shù)0.2%)、麥曲(質(zhì)量分數(shù)0.7%)、清水(質(zhì)量分數(shù)130%)以及自制的純紅曲米(質(zhì)量分數(shù)12.5%)混勻進行落料。前發(fā)酵28 ℃進行5 d，每天進行開耙；后發(fā)酵15 ℃進行20 d，開耙間隔2 d。在發(fā)酵時間24、72、120、168、240、360、480 h取樣，檢測發(fā)酵液的洛伐他汀含量、紅色素色價、桔霉素含量、理化指標、有機酸含量、游離氨基酸含量和揮發(fā)性風味物質(zhì)含量。

1.3.6紅曲黃酒指標的測定方法

常規(guī)理化指標的測定：酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮參照GB/T 13662—2018《黃酒》進行檢測，還原糖采用二硝基水楊酸(DNS)法檢測[15]。

有機酸含量的測定：參考文獻[16]，采用HPLC法測定。

游離氨基酸含量的測定：參考QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定 高效液相色譜法》并稍作修改進行測定。

揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定：參考文獻[16]，采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法測定揮發(fā)性風味物質(zhì)含量。通過NIST(National Institute of Standards and Technology)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)合標準物質(zhì)進行定性分析，再采用SPME方法對外標混合物進行檢測，以外標法進行全定量，同時添加內(nèi)標2-辛醇(101.8 mg/L)作為參考。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018 軟件、SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。計算結(jié)果采用“平均值±標準偏差”表示，并進行方差分析，其中P<0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌的篩選結(jié)果

2.1.1紅曲菌產(chǎn)洛伐他汀能力比較

通過稀釋涂布和分離純化，從40份紅曲樣品中分離出49株具有代表性的紅曲菌菌株。對49株紅曲菌進行固態(tài)制曲實驗，檢測發(fā)酵結(jié)束后紅曲中的洛伐他汀含量及色價，最終篩選出10株產(chǎn)洛伐他汀和色素能力較強的優(yōu)良紅曲菌株，結(jié)果見圖1。在這10株紅曲菌株中，菌株H5-3的產(chǎn)洛伐他汀能力顯著高于其他菌株(P<0.05)，產(chǎn)量高達17.90 mg/g。參考GB 1886.19—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 紅曲米》采用分光光度計法測定OD505 nm值代表紅色素色價，并參考文獻[17]補充測定OD410 nm、OD465 nm值代表黃色素色價、橙色素色價，結(jié)果見圖1(b)。菌株H40-2產(chǎn)紅色素含量最高，色價為4 391.14 μ/g，菌株H5-3紅色素產(chǎn)量的色價為3 195.27 μ/g，符合我國紅曲米標準GB 1886.19—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 紅曲米》。

圖1 紅曲菌產(chǎn)洛伐他汀和紅曲色素能力比較

2.1.2紅曲菌產(chǎn)桔霉素情況比較

紅曲霉在代謝產(chǎn)生洛伐他汀、紅曲色素等有益代謝產(chǎn)物的同時，也會產(chǎn)生一定含量的桔霉素，不同種紅曲霉生成桔霉素的能力是有差異的，所以對10株紅曲菌的桔霉素產(chǎn)量進行了比較分析，結(jié)果見表1。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述10株紅曲菌桔霉素產(chǎn)量均低于50 μg/kg，尤其是菌株H5-3、H40-1并未檢測到桔霉素的產(chǎn)生，目前在GB 1886.19—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 紅曲米》中，桔霉素并未被列入檢測指標，而在QB/T 2847—2007《功能紅曲米》中對功能紅曲米中桔霉素限量為50 μg/kg，因此這10株紅曲菌均符合輕工行業(yè)標準。

表1 紅曲菌產(chǎn)桔霉素含量情況

2.1.3紅曲菌產(chǎn)酶能力比較

紅曲菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生多種酶類，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等。其中淀粉酶能將淀粉分解成糊精、麥芽糖等，糖化酶接著將它們降解成葡萄糖。蛋白酶通常將大米的蛋白質(zhì)分解為多肽、氨基酸等，既促進酵母快速繁殖，還為發(fā)酵后期醇類、醛類、酮類等風味物質(zhì)的形成提供前體物質(zhì)。本研究比較了獲得的10株紅曲菌產(chǎn)糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶的能力，結(jié)果見圖2。由圖2可知，高產(chǎn)洛伐他汀菌株H5-3產(chǎn)糖化酶、酸性蛋白酶能力顯著高于其他菌株(P<0.05)，其糖化酶活、酸性蛋白酶活力分別為2 514.26、300.19 U/g，符合釀造紅曲要求。高產(chǎn)洛伐他汀的菌株H5-3產(chǎn)液化酶能力較低，為0.32 U/g。目前，用于紅曲黃酒釀造的紅曲菌產(chǎn)液化酶活力均較弱，故在紅曲黃酒的釀造過程中添加麥曲進行共酵，從而提升黃酒品質(zhì)。

圖2 紅曲菌產(chǎn)糖化酶、液化酶和酸性蛋白酶能力比較

固態(tài)發(fā)酵是目前生產(chǎn)功能紅曲的常用方法，常聰?shù)萚18]、李闊闊等[19]、吳雙雙等[20]通過誘變技術及固態(tài)發(fā)酵實驗篩選出的高產(chǎn)洛伐他汀的紅曲菌株，洛伐他汀產(chǎn)量均低于10 mg/g。本研究基于對10株紅曲菌產(chǎn)洛伐他汀、色素、桔霉素以及酶活能力的比較分析，篩選獲得的菌株H5-3不僅具有高產(chǎn)洛伐他汀的能力，產(chǎn)色素能力也不低，更不產(chǎn)桔霉素，同時也高產(chǎn)糖化酶、酸性蛋白酶，是可應用于紅曲黃酒釀造的功能紅曲菌。

2.2 菌株H5-3的鑒定結(jié)果

2.2.1形態(tài)觀察結(jié)果

對H5-3菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d后，進行形態(tài)觀察，見圖3。由圖3可知，菌落直徑21～22 mm，平坦，有中度密集且短的氣生菌絲，呈叢卷毛狀，通常為橙紅色，邊緣不規(guī)則。在高倍顯微鏡下觀察，菌株H5-3菌絲分支繁多，且呈不規(guī)則狀；閉囊殼呈球形，著生于似柄的菌絲上，整體呈橙紅色，子囊孢子呈橢圓形。參考《真菌鑒定手冊》[21]，并根據(jù)《紅曲菌的形態(tài)與分類學》[22]進行檢索，該菌株初步鑒定為紫色紅曲菌。

2.2.2分子生物學鑒定結(jié)果

菌株H5-3基于ITS基因、β-微管蛋白(Bt2a/Bt2b)基因序列的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，凝膠電泳結(jié)果見圖4。由圖4可知，產(chǎn)物片段大小均約為500 bp，條帶明顯，符合測序要求。對菌株H5-3 ITS rDNA基因和β-微管蛋白基因序列進行測序分析，所得序列分別在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源序列比對，并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。由圖5可知，菌株H5-3與紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)的同源性最高，相似度高達99%以上。結(jié)合形態(tài)學觀察結(jié)果，將菌株H5-3鑒定為紫色紅曲菌(M.purpureus)。該菌是食品工業(yè)上常見的紅曲菌種之一，是大多數(shù)紅曲產(chǎn)品標準中的指定菌株，也是國家衛(wèi)生部門認定的可用于保健食品的安全菌種，產(chǎn)洛伐他汀和紅曲色素能力較強。

圖4 菌株H5-3的rDNA-ITS PCR產(chǎn)物及rDNA-β-微管蛋白 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖5 基于ITS序列與β-微管蛋白序列構(gòu)建的菌株H5-3系統(tǒng)進化樹

2.3 菌株H5-3釀造紅曲黃酒的分析結(jié)果

2.3.1紅曲黃酒理化指標測定結(jié)果

將篩選獲得的高產(chǎn)洛伐他汀的紅曲菌H5-3固態(tài)發(fā)酵制成紅曲，并進行紅曲黃酒的釀造。發(fā)酵后所得的紅曲黃酒理化指標見表2，酒精度14.86%，總酸4.90 g/L，氨基酸態(tài)氮0.83 g/L，由于紅曲液化力偏低，故在釀酒過程中添加了麥曲，進而使酒中氨基酸態(tài)氮含量偏高。酒體色澤鮮艷紅潤，色價為22.86 μ/mL，洛伐他汀含量達63.75 mg/L，并且無桔霉素檢出。與王龍等[23]、夏艷秋等[24]研制的功能性紅曲黃酒相比，本研究制備的功能性紅曲黃酒不僅含有更高的洛伐他汀，色價也更高。

表2 紅曲黃酒理化指標測定結(jié)果

2.3.2紅曲黃酒發(fā)酵過程中洛伐他汀和紅色素色價的變化

紅曲酒在釀造過程中的洛伐他汀含量和紅色素色價的變化情況見圖6。由圖6可知，在紅曲酒發(fā)酵的0～120 h內(nèi)，發(fā)酵液中洛伐他汀含量、色價迅速增加，分別達到68.23 mg/L、24.44 μ/mL；接著48 h后發(fā)酵醪中的洛伐他汀含量、色價略微下降，發(fā)酵結(jié)束時紅曲酒中的洛伐他汀含量、紅色素色價分別為63.75 mg/L、22.86 μ/mL。研究表明紅曲黃酒中的洛伐他汀主要來源于紅曲原料[4]。在紅曲黃酒發(fā)酵過程中，紅曲中的洛伐他汀會逐漸被浸提到發(fā)酵醪中，因此紅曲中的洛伐他汀含量越高，紅曲酒中的洛伐他汀含量也就越高。

圖6 紅曲黃酒發(fā)酵過程中洛伐他汀含量和紅色素色價的變化

2.3.3紅曲黃酒中主要風味物質(zhì)分析

紅曲黃酒的風味物質(zhì)主要有游離氨基酸、有機酸和揮發(fā)性風味物質(zhì)，它們對紅曲黃酒的品質(zhì)起著重要作用。對紅曲黃酒中的有機酸、游離氨基酸和揮發(fā)性風味物質(zhì)進行檢測，結(jié)果見圖7和表3。由圖7可知，發(fā)酵結(jié)束后的紅曲黃酒有機酸總量達12.70 g/L，乳酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸為主要成分，分別占總量的28.2%、21.9%、14.5%、12.2%、5.7%，除檸檬酸含量較低外，其余有機酸成分比例與福建清爽紅曲酒[25]相似；紅曲黃酒游離氨基酸總量3 540.58 mg/L，甜味、苦味、澀味、鮮味4種氨基酸風味比例與文獻[14]一致。

紅曲黃酒主要揮發(fā)性風味物質(zhì)及含量見表3。由表3可知，紅曲黃酒中共檢測出包括13種酯類、6種醇類、6種醛類、4種酸類、4種酚類在內(nèi)的共33種風味物質(zhì)。在紅曲酒揮發(fā)性風味物質(zhì)中，酯類、醇類為主要成分，分別占總量的48.4%、43.9%，其中乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、正丙醇、苯乙醇等含量較高，對風味有較大貢獻。在紅曲黃酒中檢測到酚類物質(zhì)總量為(5.04±0.74)mg/L，主要是愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、苯酚，與文獻[26]中福建老酒等酒類相比，具有較高的酚類物質(zhì)含量。與文獻[25-26]中報道的紅曲黃酒揮發(fā)性風味物質(zhì)組分相比，本研究制備的功能紅曲黃酒呈香正常，符合紅曲黃酒的基本風味特征。

表3 紅曲黃酒中的主要揮發(fā)性風味物質(zhì)及含量

3 結(jié) 論

為獲得釀酒用高產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌株，本研究以洛伐他汀含量、紅曲色素色價、桔霉素含量及紅曲菌產(chǎn)酶能力為評價指標，通過對不同產(chǎn)地40份紅曲樣品中的紅曲菌進行分離純化與固態(tài)發(fā)酵篩選，獲得了1株高產(chǎn)洛伐他汀的菌株H5-3，經(jīng)形態(tài)觀察和分子生物學鑒定，判定該菌株為紫色紅曲菌(M.purpureus)。經(jīng)過檢測，菌株H5-3的洛伐他汀產(chǎn)量高達17.90 mg/g，紅色素色價3 195.27 μ/g，糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶的活力分別達2 514.26、0.32、300.19 U/g，且該菌株不產(chǎn)桔霉素，是可應用于紅曲黃酒釀造的功能紅曲霉菌。進一步將該紫色紅曲菌H5-3應用于紅曲黃酒的釀造，制得的紅曲黃酒中洛伐他汀質(zhì)量濃度63.75 mg/L，紅色素色價22.86 μ/mL，酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮等各項紅曲酒理化指標均符合黃酒國家標準。對制得的紅曲黃酒風味物質(zhì)進行分析，有機酸、游離氨基酸和揮發(fā)性風味物質(zhì)含量比例協(xié)調(diào)，酯類、醇類、酚類等揮發(fā)性風味物質(zhì)含量較高，風味口感較佳。但本研究僅對篩選到的高產(chǎn)洛伐他汀菌株進行釀造驗證，而其高產(chǎn)洛伐他汀的機理值得進一步探究。