徐 磊，鐘佳蓮，余勛信，劉毅發(fā)，黃 瑜，劉小龍，賴隆永，閆麗萍，許秀梅，宋素泉*，張淵魁*

(1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350119；2.福建省禽病防治重點實驗室，福州 350013；3.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013；4.派生特(福州)生物科技有限公司，福州 350500；5.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；6.兆豐華生物科技(南京)有限公司，南京 211102)

養(yǎng)雞業(yè)在我國國民經(jīng)濟中占據(jù)重要地位，但禽病始終制約著我國養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展。其中，新城疫(Newcastle disease,ND)就是危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展最為重要的烈性傳染病之一[1-2]。我國主要采用不同毒力的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)弱毒疫苗和油乳劑滅活疫苗防控ND，在一定程度上控制了ND的大規(guī)模流行，但是環(huán)境應(yīng)激、疫苗保護力限制、免疫抑制等多種因素導(dǎo)致ND仍然于免疫雞群時有發(fā)生，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[3-4]。因此，ND新型疫苗及其免疫佐劑的研發(fā)是將來工作方向[5-6]。

轉(zhuǎn)移因子(transfer factor,TF)是一種由T淋巴細胞釋放的能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的細胞因子，可以提高雞免疫功能和緩解雞免疫抑制[7-9]。包括本課題組在內(nèi)的多項研究顯示，TF可增強NDV疫苗的免疫效果[10-12]。為了進一步明確TF提高NDV疫苗攻毒保護率的作用及機理，本試驗對NDV LaSota弱毒疫苗株與TF聯(lián)合免疫后NDV F48E9強毒株攻毒的免疫應(yīng)答進行研究，應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)與ELISA方法研究NDV感染后雞外周血細胞因子濃度的動態(tài)變化規(guī)律，以期為NDV疫苗免疫機理的研究、疫苗免疫佐劑的研發(fā)和更有效預(yù)防NDV提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗與病毒株

NDV LaSota株弱毒疫苗由兆豐華生物科技(南京)有限公司提供，NDV F48E9株強毒[13]由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。NDV LaSota株弱毒疫苗病毒含量為107.17EID50·羽份-1，NDV F48E9株病毒含量為105.0ELD50·mL-1。

1.2 主要試劑及儀器

Chicken IL-4 ELISA Kit購自Lifespan Biosciences公司；Chicken Cytokine Array Kit購自Ray Biotech公司；Innoscan 300動態(tài)激光共聚焦掃描儀購自Innopsys公司；全自動酶標儀購自Bio Rad公司；動物飼養(yǎng)隔離器購自蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司。

1.3 TF制備

按照本實驗室已授權(quán)的國家發(fā)明專利制備豬脾TF[14-15]：以健康豬脾為原料，經(jīng)勻漿、細胞破碎、分離、滅活、微濾、超濾后精制而成。經(jīng)檢驗，所制備豬脾TF的pH為7.0，多肽含量為3.5 mg·mL-1，核糖含量為72.0 μg·mL-1，脫E受體法效力檢驗活力為15%，細菌內(nèi)毒素含量小于10 EU·mL-1，在252 nm波長處有最大吸收，OD260 nm/OD280 nm的比值為2.23，蛋白質(zhì)定性檢驗、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗、熱原檢驗、異常毒性檢查、過敏反應(yīng)檢查和安全檢驗均合格。

1.4 實驗動物

SPF雞購自濟南斯帕法斯家禽有限公司，攻毒前在正壓動物飼養(yǎng)隔離器中飼養(yǎng)，30日齡免疫接種，44日齡轉(zhuǎn)至負壓動物飼養(yǎng)隔離器中攻毒飼養(yǎng)。

1.5 TF對LaSota株弱毒疫苗攻毒保護率的影響

選取200羽SPF雞隨機分為10組，每組各20羽，分別為：單獨免疫組1與聯(lián)合免疫組1(均點眼免疫10-2羽份LaSota株弱毒疫苗)、單獨免疫組2與聯(lián)合免疫組2(均點眼免疫10-3羽份LaSota株弱毒疫苗)、單獨免疫組3與聯(lián)合免疫組3(均點眼免疫10-4羽份LaSota株弱毒疫苗)、單獨免疫組4與聯(lián)合免疫組4(均點眼免疫10-5羽份LaSota株弱毒疫苗)、對照組1與空白組1(均不免疫)，同時，4個聯(lián)合免疫組均肌內(nèi)注射0.2 mL TF。免疫后第14天，4個單獨免疫組、4個聯(lián)合免疫組與對照組1均肌內(nèi)注射0.5 mL NDV F48E9株強毒，設(shè)立空白組1為非免疫非攻毒組，見表1。每日觀察臨床癥狀至攻毒后第14天，剖檢病死雞和試驗結(jié)束時存活雞。

表1 試驗設(shè)計Table 1 Experimental design

攻毒后SPF雞出現(xiàn)扭頸、翅膀麻痹、癱瘓等ND典型臨床癥狀，或全身黏膜和漿膜出血、盲腸扁桃體腫大、出血、壞死等ND典型剖檢病變，或病死，則判為SPF雞發(fā)病[16]。SPF雞發(fā)病即判為不保護，相反,SPF雞臨床健康即判為保護，統(tǒng)計各劑量組SPF雞的發(fā)病率和死亡率，按Reed-Muench法計算半數(shù)保護量(median protective dose,PD50)[17]。

1.6 血清中IL-4、IFN-γ、IL-12 P40含量測定

選取240羽SPF雞隨機分為4組，每組各60羽，分別為單獨免疫組、聯(lián)合免疫組、對照組與空白組，其免疫及攻毒試驗設(shè)計分別與單獨免疫組2、聯(lián)合免疫組2、對照組1、空白組1一致，并分別于免疫前3天、免疫后第7、14天以及攻毒后第1、3、7、14天依次抽取各組不重復(fù)的5羽SPF雞(攻毒后優(yōu)先抽取臨床健康雞)血樣,經(jīng)前翅靜脈采集、分離血清測定IL-4、IFN-γ、IL-12 P40 3種細胞因子濃度。

IL-4含量測定按照Chicken IL-4 ELISA Kit操作步驟進行，IFN-γ和IL-12 P40含量測定按照Chicken Cytokine Array Kit操作步驟進行，分別采用酶標儀和動態(tài)激光共聚焦掃描儀讀取吸光度值和熒光信號，制作標準曲線，計算樣品濃度。若細胞因子濃度低于相應(yīng)Kit陰性對照標準品的吸光度值或熒光信號而不可檢出時，本研究以0 pg·mL-1表示。所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析和最小顯著性差法(LSD)分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀及攻毒保護率

免疫后，各組雞精神、采食、飲水、糞便均正常，TF注射部位無腫脹、無壞死、無炎癥等異常變化，未見局部和全身不良反應(yīng)。攻毒后，單獨免疫組1和聯(lián)合免疫組1均無發(fā)病、無死亡，保護率100%。單獨免疫組2共有9羽雞于攻毒后第2天開始表現(xiàn)ND典型臨床癥狀，并于攻毒后第3、4和5天分別死亡2、3、3羽，死亡率40%；余下1羽雞于攻毒10天后恢復(fù)正常，保護率55%。聯(lián)合免疫組2共有5羽雞于攻毒后第3天開始表現(xiàn)ND典型臨床癥狀，并于攻毒后第4和5天分別死亡3、1羽，死亡率20%；余下1羽雞于攻毒9 d后恢復(fù)正常，保護率75%。此外，單獨免疫組3、聯(lián)合免疫組3、單獨免疫組4和聯(lián)合免疫組4的雞均于攻毒后第2天，而對照組1的雞于攻毒后第1天，開始表現(xiàn)ND典型臨床癥狀，各組雞死亡高峰依次集中在：攻毒后第3～5天、第3～6天、第3～4天、第3～5天、第2～4天，死亡率100%，保護率0%?？瞻捉M1無發(fā)病、無死亡(表2)。

表2 各組的保護效率Table 2 Protection of the chickens in each vaccinated group against challenging with virulent NDV

2.2 剖檢變化及PD50

攻毒后，各組病死雞出現(xiàn)ND典型剖檢病變。此外，單獨免疫組2與聯(lián)合免疫組2中各有1羽病愈雞，剖檢病變不典型，僅在腺胃乳頭和十二指腸出現(xiàn)少量出血點，以及在脾表面出現(xiàn)少量白色壞死點。而剖檢空白組1雞和其他各組免疫保護雞，則未發(fā)現(xiàn)病變。

統(tǒng)計不同劑量NDV疫苗的攻毒試驗結(jié)果并按Reed-Muench法計算PD50(表3與表4)，結(jié)果顯示，單獨免疫組中疫苗的一個PD50為0.000 8羽份，即：該NDV疫苗單獨接種0.000 8羽份可以使50%的雞獲得保護。聯(lián)合免疫組中疫苗的一個PD50為0.000 5羽份，即：該NDV疫苗與TF聯(lián)合免疫僅需接種0.000 5羽份可以使50%的雞獲得保護，比單獨免疫組中疫苗PD50減少了37.5%。

表3 單獨免疫組接種不同劑量NDV疫苗的攻毒試驗結(jié)果Table 3 Challenge test in vaccination group without TF immunized with different doses of NDV vaccine

表4 聯(lián)合免疫組接種不同劑量NDV疫苗的攻毒試驗結(jié)果Table 4 Challenge test in vaccination group with TF immunized with different doses of NDV vaccine

2.3 血清中IL-4、IFN-γ、IL-12 P40含量測定

統(tǒng)計攻毒后各組的死亡率、發(fā)病率和保護率(圖1)，其中，單獨免疫組分別為45%、45%和55%，聯(lián)合免疫組分別為25%、25%和75%，對照組分別為100%、100%和0%，而空白組無發(fā)病、無死亡。

圖1 攻毒后各組試驗雞的存活情況Fig.1 The survival chickens of each group after challenge

2.3.1 IL-4含量的變化 免疫前IL-4含量，各組均不可檢出。免疫后，聯(lián)合免疫組明顯增加，由0 pg·mL-1(免疫前第3天)顯著增加至19.62 pg·mL-1(免疫后第7天)和37.14 pg·mL-1(免疫后第14天)，而其余組均不可檢出。攻毒后，聯(lián)合免疫組于第1天迅速下降至22.33 pg·mL-1，隨后明顯增加并于第14天達到48.46 pg·mL-1，而單獨免疫組明顯增加并于第14天達到31.48 pg·mL-1，對照組與空白組變化不顯著。免疫及攻毒后各時間點聯(lián)合免疫組均高于其他組，并于免疫后第7、14天和攻毒后第1、14天差異極顯著(P<0.01)。攻毒后各時間點單獨免疫組均極顯著高于對照組與空白組(P<0.01)，對照組與空白組IL-4含量接近且差異不顯著，見圖2A。

2.3.2 IFN-γ含量的變化 免疫前IFN-γ含量，各組接近且差異不顯著。免疫后尤其是攻毒后，聯(lián)合免疫組與單獨免疫組明顯增加，其中，各時間點聯(lián)合免疫組均高于其他組，于免疫后第7、14天和攻毒后第1、3天差異極顯著(P<0.01)，并于攻毒后第1天達到高峰值(296.15 pg·mL-1)；各時間點單獨免疫組均高于對照組與空白組，于免疫后第14天極顯著高于對照組與空白組(P<0.01)，于攻毒后第3天極顯著高于空白組(P<0.01)，并于攻毒后第3天達到高峰值(109.51 pg·mL-1)；各時間點對照組高于空白組，但差異不顯著，見圖2B。

2.3.3 IL-12 P40含量的變化 免疫前及免疫后各時間點IL-12 P40含量，各組接近且差異不顯著。攻毒后，聯(lián)合免疫組于第1天即達到高峰值(18.98 pg·mL-1)，且各時間點均高于其他組，并于攻毒后第1天差異極顯著(P<0.01)；單獨免疫組于第3天達到高峰值(8.04 pg·mL-1)，此時低于聯(lián)合免疫組而高于對照組(差異不顯著)，但空白組顯著低于其他組(P<0.05)，見圖2C。

3 討 論

NDV只有1個血清型，但具有多種基因型，我國主要流行的NDV基因型具有多樣性且在不斷進化中，個別地區(qū)還出現(xiàn)了新基因型[18]。許多學(xué)者采用不同NDV基因型毒株分別對LaSota株(基因Ⅱ型)弱毒疫苗免疫雞開展了攻毒保護試驗，因免疫劑量、日齡和攻毒毒株、途徑等的不同，攻毒保護率結(jié)果不同[19-20]。在本研究中，點眼免疫10-2、10-3、10-4、10-5羽份LaSota株弱毒疫苗(107.17EID50·羽份-1)對NDV F48E9株強毒(基因Ⅸ型)的攻毒保護率分別為100%、55%、0%和0%，單獨免疫組中疫苗的一個PD50為0.000 8羽份。

已有多種免疫佐劑用于增強NDV疫苗免疫效果的研究，其中，TF顯示了較好的免疫增效作用，并在TF提高ND抗體效價、淋巴細胞轉(zhuǎn)化水平、巨噬細胞吞噬能力等免疫學(xué)指標方面開展了深入研究[8-12]，但是在TF提高NDV疫苗攻毒保護率及其作用機制方面鮮有報道。在本研究中，TF聯(lián)合10-2、10-3、10-4、10-5羽份LaSota株弱毒疫苗點眼免疫對NDV F48E9株強毒的攻毒保護率分別為100%、75%、0%和0%。其中，在免疫10-3羽份LaSota株弱毒疫苗時相比單獨免疫組2的攻毒保護率(55%)，聯(lián)合免疫組2的攻毒保護率(75%)顯著提高，提高了20%。此外，聯(lián)合免疫組中疫苗的一個PD50為0.000 5羽份，比單獨免疫組中疫苗PD50(0.000 8羽份)減少了37.5%，即：相比單獨免疫方式，LaSota株弱毒疫苗與TF聯(lián)合免疫僅需單獨免疫時62.5%的NDV病毒用量即可獲得相同的攻毒保護率。結(jié)果表明，TF可增強LaSota株弱毒疫苗的攻毒保護率。

豬脾TF的原料資源豐富，豬脾多作為屠宰廢棄物，有利于產(chǎn)業(yè)向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展，研究顯示[10,21]，雞脾TF和豬脾TF均可增強家禽免疫功能和疫苗免疫效果，但雞脾TF效果會優(yōu)于豬脾TF。與此研究結(jié)果類似，本課題組另有試驗顯示(另文報道)，雞法氏囊素與LaSota株弱毒疫苗聯(lián)合免疫的攻毒保護率明顯高于豬脾TF，而PD50明顯低于豬脾TF，即：對LaSota株弱毒疫苗的免疫增效作用會顯著高于豬脾TF，這與免疫佐劑的來源動物種間差異是否有關(guān)仍需作進一步研究，為不同疫苗佐劑的研發(fā)提供了參考依據(jù)。

TF分子量小于10 ku，具有分子質(zhì)量小、無抗原性、無毒副作用和不引起過敏反應(yīng)等優(yōu)點[7-12,14-15]。本試驗結(jié)果也驗證了TF使用安全，TF肌注后各組雞均健康，未見局部和全身不良反應(yīng)。攻毒后，各組免疫保護雞臨床表現(xiàn)和剖檢變化均正常；各組病死雞均表現(xiàn)ND典型的臨床癥狀和剖檢病變；此外，單獨免疫組2與聯(lián)合免疫組2中各有1羽病愈雞，臨床癥狀表現(xiàn)典型，剖檢病變不典型，聯(lián)合免疫組2病愈雞相比單獨免疫組2病愈雞提前1 d恢復(fù)正常。其中，對照組1開始出現(xiàn)臨床癥狀和病死雞的日齡最早，分別為攻毒后第1、2天；而單獨免疫組2開始出現(xiàn)臨床癥狀和病死雞的日齡相比聯(lián)合免疫組2提前1 d，聯(lián)合免疫組3和聯(lián)合免疫組4最后病死雞日齡相比單獨免疫組3和單獨免疫組4分別延遲1 d。臨床癥狀和剖檢變化結(jié)果表明，TF聯(lián)合LaSota株弱毒疫苗聯(lián)合免疫優(yōu)于單獨免疫。

在免疫應(yīng)答過程中細胞因子發(fā)揮著重要作用，IL-4與IFN-γ分別是Th2和Th1細胞免疫應(yīng)答的信號細胞因子，可分別介導(dǎo)體液免疫與細胞免疫[22-23]。IL-12是由IL-12 p40和IL-12 p35兩個亞基組成的異源二聚體，是一種重要的調(diào)節(jié)性細胞因子，可誘導(dǎo)Th0向Th1分化和大量IFN-γ產(chǎn)生，促進機體細胞免疫[24]。在本研究中，IFN-γ和IL-12 P40含量測定采用了蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合了ELISA檢測靈敏度高、特異性強、陣列高通量的優(yōu)點[25]。結(jié)果顯示，免疫后各時間點，聯(lián)合免疫組IL-4和IFN-γ含量均高于其他組，并于第7、14天差異極顯著(P<0.01)；單獨免疫組IFN-γ含量高于對照組與空白組，并于第14天差異極顯著(P<0.01)；而各組IL-12 P40含量接近，差異不顯著。表明免疫NDV弱毒疫苗LaSota株可顯著提高雞IFN-γ水平，與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[26]，而TF可顯著提高NDV弱毒疫苗LaSota株免疫雞IL-4和IFN-γ水平。

A.IL-4；B.IFN-γ；C.IL-12 P40。“*”表示聯(lián)合免疫組極顯著高于其他組(P<0.01)A.IL-4;B.IFN-γ;C.IL-12 P40.“*”showed that the vaccination group with TF was significantly higher than other groups (P<0.01)圖2 免疫或攻毒后各組試驗雞外周血IL-4、IFN-γ和IL-12 P40的變化Fig.2 Levels of IL-4,IFN-γ and IL-12 P40 in PBMC after vaccination or challenge

本研究攻毒后1 d，聯(lián)合免疫組IL-4和IFN-γ表達呈負相關(guān)，前者含量明顯下降(下降了14.80 pg·mL-1)，后者含量明顯提高(提高了238.72 pg·mL-1)，推測與IL-12的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，此時IL-12 P40明顯增加并達到高峰值(18.98 pg·mL-1)。聯(lián)合免疫組IFN-γ和IL-12 P40含量高峰值出現(xiàn)時間(攻毒后第1天)均比單獨免疫組(攻毒后第3天)提前了2 d。攻毒后各時間點，聯(lián)合免疫組IL-4、IFN-γ和IL-12 P40含量均高于其他組，其中，IL-4于第1、14天，IFN-γ于第1、3天，IL-12 P40于第1天差異極顯著(P<0.01)；單獨免疫組IL-4、IFN-γ含量高于對照組與空白組，其中，IL-4于攻毒后各時間點，IFN-γ于攻毒后第3天差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，TF與NDV弱毒疫苗LaSota株聯(lián)合免疫可增強IFN-γ、IL-12介導(dǎo)的細胞免疫和IL-4介導(dǎo)的體液免疫。

4 結(jié) 論

對TF提高NDV弱毒疫苗LaSota株攻毒保護率的效果及機制進行了研究，結(jié)果表明，TF可增強IFN-γ、IL-12介導(dǎo)的細胞免疫和IL-4介導(dǎo)的體液免疫，提高LaSota株弱毒疫苗的免疫保護率，降低疫苗PD50；在抵抗NDV F48E9強毒攻擊時，聯(lián)合免疫組的免疫保護率明顯高于單獨免疫組。