張 康，郭志廷，仇正英，張景艷，王 磊，張 凱，王貴波，梁芬芬，馬 倩*，李建喜*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)新重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730050）

0 引言

【研究意義】牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）隸屬黃病毒科、瘟病毒屬，是一個較大的ORF（開放閱讀框）[1?2]，主要包括三個部分3′UTR（3′非翻譯區(qū)）、ORF編碼區(qū)、5′UTR（5′非翻譯區(qū)）。5′UTR序列在整個基因系列中具有高度的保守性，根據(jù)這組基因的特點設(shè)計引物能夠在分子水平對BVDV進(jìn)行診斷，并對其進(jìn)行病原基因分型[3]。目前BVDV是一種威脅全球養(yǎng)牛業(yè)的重要病原體[4]。BVDV能夠穿過懷孕母牛的胎盤屏障感染胎兒，從而生出攜帶有大量病原的持續(xù)感染（PI）犢牛[5]。該PI牛通常出生后體弱多病，并且由于其自身免疫系統(tǒng)的損傷，特別容易伴隨機會性感染。PI牛在臨床上通常出現(xiàn)死亡率極高的遲發(fā)型粘膜病[6]，嚴(yán)重影響牛群健康，對養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失[7]。因此控制BVDV感染最有效的手段就是PI牛的早期診斷[8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國內(nèi)外檢測BVDV的方法繁多，包括免疫組織化學(xué)（IHC）、抗原ELISA、RT-PCR和RT-qPCR以及最近開發(fā)的RT-ELISA和交叉引物恒溫擴增技術(shù)[9]。Driskell等[10]建立檢測BVDV的免疫組織化學(xué)（IHC）方法，其優(yōu)點是適合批量臨床樣本檢測，但需要操作熟練的穩(wěn)定人員和新鮮完整的組織樣本；李家偉等[11]建立牛病毒性腹瀉病毒LAMP檢測方法，其優(yōu)點是可現(xiàn)場操作，但極易出現(xiàn)假陽性；范晴等[12]與胡俊英等[13]建立的牛病毒性腹瀉病毒抗原ELISA檢測方法，其包被蛋白暫不能批量生產(chǎn)滿足臨床檢測需求；王榮等[14]提出的使用實時熒光定量RT-PCR檢測BVDV的方法不如探針技術(shù)敏感性高。而我國診斷BVDV國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)定首先采用培養(yǎng)細(xì)胞分離病毒的方法，其分離鑒定法主要通過接種牛腎細(xì)胞，一般需傳至1～3代左右才能出現(xiàn)明顯病變，具備分離條件的實驗少，因此不適用批量檢測臨床樣本[15]?！颈狙芯壳腥朦c】以上每個檢測方法在靈敏度、成本和耗時方面都存在著優(yōu)缺點。而熒光定量PCR（real-time PCR）技術(shù)是一種能夠?qū)崟r、快速、敏感、準(zhǔn)確地檢測病毒在體內(nèi)的分布及變化且能克服其他方法檢測不足的技術(shù)，因此在病原診斷、病原定量檢測及抗病毒機制等方面得到了廣泛應(yīng)用[9,16]。應(yīng)用熒光定量PCR方法診斷牛病毒性腹瀉病毒的研究尚待深入探討。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究對GenBank提交的BVDV 5′UTR基因序列進(jìn)行比對，對TaqMan通用探針、BVDV的引物進(jìn)行改造、設(shè)計，以期創(chuàng)建具有靈敏度高、特異性強、能夠相對定量且快速便捷的檢查方法，為獸醫(yī)工作者研究和快速診斷牛病毒性腹瀉病毒提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒和樣品

從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購進(jìn)BVDV陽性樣品，編號為CVCC AV67，存放于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所獸醫(yī)室實驗室。牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）疫苗購自金宇保靈生物藥品有限公司，口蹄疫病毒（FMDV）滅活疫苗購自中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，豬瘟病毒（CSFV）疫苗、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）疫苗購自青島易邦生物工程有限公司。從甘肅、青海和陜西等省份的奶牛養(yǎng)殖戶中收集到65份臨床癥狀疑似受牛病毒性腹瀉病毒感染的腹瀉牛糞便樣品（獸醫(yī)根據(jù)腹瀉牛體格瘦小、抵抗能力差、免疫力低下和使用抗生素治療無效等篩選出疑似BVDV感染牛進(jìn)行采樣）。

1.2 主要儀器及試劑

熒光定量PCR儀，紫外分光光度計，凝膠成像儀；Dnase-FreeRNase，Rnas-Free DnaseI，T7 RNA Polymerase，MaximaH M inus First StrandcDNA Synthesis Kit；2×EsTaqMasterM ix；病 毒DNA/RNA提取試劑盒、DNA瓊脂糖膠回收試劑盒、EasyPURE RNA Purification Kit、One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物設(shè)計和合成

引物的設(shè)計登錄NCBI從GenBank下載BVDV 5′UTR保守區(qū)域基因序列，使用MegA lign軟件對其進(jìn)行對比，選擇其相對保守位置，利用Oligo6.0進(jìn)行分析，設(shè)計2對特異性引物（標(biāo)準(zhǔn)品引物A-F/BR和定量引物Q-F/Q-R）和1條探針，其中標(biāo)準(zhǔn)品上已加有T7啟動子，下游引物加有多聚T尾巴（表1），均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 引物和探針Table 1 Prim ersand probesapp lied

1.4 樣品RNA的提取

按照試劑盒中的說明書進(jìn)行操作，樣本中提取總RNA，置于－20 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以陽性樣品提取的RNA 作為模板進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，以引物A-F和B-R作為擴增引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物的擴增，依照膠回收試劑盒的說明對其進(jìn)行操作，可以得到純化回收目的片段，之后按照T7RNA Polymerase相關(guān)說明，對其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)錄后純化所得到的產(chǎn)物即為體外轉(zhuǎn)錄所制備的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 熒光定量PCR方法的建立

以BVDV的陽性標(biāo)準(zhǔn)品作為模板建立熒光PCR方法，配制的熒光PCR反應(yīng)體系包括以下組分：2×One Step RT-PCR Buffer III反應(yīng)液10μL，TaKaRa ExTaqHS反應(yīng)液0.4μL，PrimeScript RT Enzyme M ix II反應(yīng)液0.4μL，上游引物（10μmol·L?1）和下游引物（10μmol·L?1）各0.4μL，熒光探針（5μmol·L?1）0.8μL，RNA標(biāo)準(zhǔn)品2μL，用ddH2O補充至20μL，擴增條件為：溫度45℃時間5m in，95℃10 s，40個擴增循環(huán)（95℃5 s、60℃20 s）。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)擴增曲線的建立和敏感性試驗

將標(biāo)準(zhǔn)品RNA模板濃度分別進(jìn)行10倍倍比稀釋，以5.0267×109copies·μL?1為 起 始 濃 度 稀 釋 到5.0267×10?1copies·μL?1，之后按照其相關(guān)要求對其進(jìn)行稀釋，不同稀釋度核酸作為模板進(jìn)行PCR擴增，將相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)濃度的Ct值作為縱軸指標(biāo)，以稀釋倍數(shù)所計算得到的對數(shù)作為橫軸指標(biāo)，畫出其標(biāo)準(zhǔn)曲線。在這個曲線基礎(chǔ)上得到熒光定量PCR的敏感程度以及最小測定值。

1.8 特異性試驗

按照上述的手段對其FMDV、BVDV、IBRV、CSFV、PRRV的DNA/RNA模板進(jìn)行擴增，對其定量PCR反應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行觀察，對特異性進(jìn)行評價。

1.9 重復(fù)性試驗

將得到的已知濃度BVDV陽性標(biāo)準(zhǔn)品按照10?2、10?3、10?4、10?5以及10?6的比例進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)行組間與組內(nèi)重復(fù)試驗，在進(jìn)行組內(nèi)試驗的過程中，需要將每一個標(biāo)準(zhǔn)使用同一種方法重復(fù)3次；在進(jìn)行組間試驗時，需要在不同的時間使用這一方法重復(fù)3次，針對測定的結(jié)果對其進(jìn)行分析，來評估本次研究的價值，能否將結(jié)果復(fù)現(xiàn)。

1.10 熒光PCR方法的應(yīng)用

使用已經(jīng)獲得的熒光定量PCR方法，對臨床收集到的65份標(biāo)本（這些標(biāo)本均為懷疑為牛病毒性腹瀉病毒感染的牛糞便）進(jìn)行擴增，出現(xiàn)了陽性結(jié)果并對本次研究的可行性程度進(jìn)行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV標(biāo)準(zhǔn)品引物的特異性擴增結(jié)果

按照相關(guān)說明書對其病毒RNA進(jìn)行擴增操作，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，對其進(jìn)行測定，獲得了分子量為325 bp左右的條帶（圖1）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品引物擴增產(chǎn)物Fig.1 Am p lification productsof RNA standard primers

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品RNA純度分析結(jié)果

紫外分光光度計測定結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)RNA原液的D260/D280值達(dá)到1.92，其質(zhì)量濃度達(dá)到35.70mg·L?1。

2.3 熒光定量PCR方法的建立和特異性試驗

將BVDV陽性核酸作為模板，對其進(jìn)行擴增，最終得到了S形曲線，同時用建立的熒光探針方法對FMDV、IBRV、CSFV和PRRS病毒進(jìn)行擴增，上述樣品都沒有得出特異性條帶，這就證實這一檢測手段對BVDV有較好的特異性，但對遺傳物質(zhì)比較類似的病毒并沒有出現(xiàn)相關(guān)的反應(yīng)（圖2）。

圖2 熒光定量PCR方法特異性試驗Fig.2 Specificity of RT-PCR assay

2.4 熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和敏感性試驗

將BVDV陽 性 核 酸（含 量 為5.026 7×109copies·μL?1）10倍稀釋后進(jìn)行擴增（表2），其數(shù)據(jù)表明，由于模板拷貝數(shù)不斷減少，Ct值逐漸上升，當(dāng)稀釋達(dá)到10?1、10?2、10?3、10?4、10?5、10?6、10?7、10?8和10?9時，Ct值 分 別 為11.17、13.48、18.68、21.43、24.13、28.44、31.22、35.16和37.69，為S形曲線，但達(dá)到10?10時，則不顯示曲線。這表明本方法的檢測極限是樣品的10?9稀釋倍數(shù)，即陽性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為5.026 7 copies·μL?1（圖3）。以10?2、10?3、10?4、10?5、10?6、10?7和10?8等不同濃度的反對數(shù)作為橫軸，以對應(yīng)的Ct值作為縱軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），可以得到相關(guān)的回歸方程：y=3.468 9x+7.303 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8，這說明Ct值與拷貝數(shù)之間呈現(xiàn)非常強的線性關(guān)系，表明該方法穩(wěn)定性好，意味著無論待檢樣品的模板濃度高低，用該方法進(jìn)行檢測都可以得到較好的試驗結(jié)果。

圖3 熒光定量PCR敏感性試驗Fig.3 Sensitivity of RT-PCR assay

表2核酸濃度Tab le 2 Nucleic acid concentration

圖4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve for RT-PCR assay

2.5 熒光PCR方法的重復(fù)性

獲取以 上的稀釋 倍數(shù)10?4、10?5、10?6、10?7和10?8的模板對其進(jìn)行重復(fù)性研究，結(jié)果表明，組內(nèi)重復(fù)試驗的變異系數(shù)（CV）平均為0.77%±0.13%，組間重復(fù)試驗的變異系數(shù)（CV）平均為0.90%±0.67%，這表明本方法的重復(fù)性較好，結(jié)果詳見表3和圖5。

圖5 熒光定量PCR重復(fù)性Fig.5 Reproducibility of RT-PCR assay

2.6 熒光定量PCR方法的應(yīng)用

用建立的熒光PCR方法對65份腹瀉牛肛門拭子樣品進(jìn)行檢測，共有4份樣品得到了S型曲線（圖6），與陽性數(shù)據(jù)相符，說明這一方式是可行的，在實際中可以使用到該疾病的流行病學(xué)監(jiān)測以及篩查PI牛等方面。

表3實時熒光定量PCR方法的變異系數(shù)Table3 Coefficientsof variation between inter- and intra-groupsof RT-PCR assay

圖6 熒光定量PCR方法的應(yīng)用Fig.6 App lication of RT-PCR assay

3 討論與結(jié)論

早期篩查PI牛是控制該病毒傳播的重要措施之一。ELISA檢測技術(shù)一直被廣泛用于檢測血液、血清、乳汁、鼻腔和口腔棉拭子中BVDV抗體水平，根據(jù)抗體水平判定是否為PI牛，而ELISA往往由于母源抗體的影響造成檢測失敗[17]。因此近年來國內(nèi)外研究人員越來越多地利用熒光定量PCR技術(shù)檢測BVDV，不僅因為其靈敏度高，最重要的原因是能夠在早期診斷鑒定PI牛，為此本試驗以GenBank中提交的BVDV 5′UTR基因序列進(jìn)行比對，設(shè)計相關(guān)的PCR檢測方法。

通過特異性、重復(fù)性以及敏感性試驗，本試驗建立的BVDV TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法，對FMDV、BVDV、IBRV和PRRS等病毒無特異性擴增。該方法靈敏度高，對病毒檢測的最低檢測靈敏度可達(dá)到5.026 7 copies·μL?1，敏感性優(yōu)于常規(guī)的RT-PCR[18]；穩(wěn)定性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)是0.99 6；重復(fù)性較好，同一時期組內(nèi)和不同時期組間變異系數(shù)均小于1.0%。

本試驗建立的熒光定量PCR方法與常規(guī)PCR檢測方法相比不需在反轉(zhuǎn)錄后再次向反應(yīng)混合物中添加任何試劑，僅在一支PCR反應(yīng)管中操作，直接由RNA定量RNA，提高了操作效率，而且減少了開管次數(shù)從而有效降低外界其他基因污染的風(fēng)險[19?20]。

本試驗顯示該方法專一測定這一病毒，因此該方法既可以用于臨床早期發(fā)現(xiàn)PI牛，又可以檢測細(xì)胞中BVDV的增殖情況，這為研究細(xì)胞水平上藥物抗BVDV及其分子機制提供了檢測手段。