劉鳳欒 秦 密 宇 勝 劉青青 張大生 田代科,*

(1 上海辰山植物園中國科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心,上海 201602；2 上海市資源植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201602；3 合肥植物園,安徽 合肥 230031)

現(xiàn)代作物良種選育技術(shù)中，物理射線輻射育種是重要的輔助手段之一。截至2020年10月，在聯(lián)合國糧農(nóng)組織/國際原子能機(jī)構(gòu)(FAO/IAEA，https://mvd.iaea.org/#!Search)登記的3 362個(gè)突變選育品種中，2 610個(gè)為物理射線誘變所得，其中1 808個(gè)使用了60Co-γ射線，占69.3%，表明60Co-γ射線已成為目前作物輻射育種的主要處理方法[1-3]。近20年，國內(nèi)外利用60Co-γ 輻射培育觀賞植物良種時(shí)，種子因易得量大、操作方便，是主要的使用材料之一[4-5]，其輻射效應(yīng)包括半致死劑量[6-8]、種子萌發(fā)效果[9-11]、幼苗生長與形態(tài)變異[12-14]、植株生理生化[4,15-18]及抗性變化[3-4,19-20]、性狀改良[21-22]、染色體結(jié)構(gòu)[23]及分子水平的遺傳變異[24-25]等，已均有報(bào)道，部分研究獲得了良好效果[26-27]。

荷花(NelumboAdans.)輻射育種的詳細(xì)報(bào)道始于2000年，我國育種者利用60Co-γ輻射30個(gè)荷花品種的雜交種子，發(fā)現(xiàn)引起變異的劑量范圍在0.5～1.5萬倫琴[28]。以泰國品種Sattabut組培苗為材料，γ射線輻射處理可使其新生葉柄發(fā)生玻璃化以及葉片出現(xiàn)輪列型氣孔[29]。隨后蓮藕也開始被用作輻射處理對象[30-31]。例如，美洲蓮(N.luteaWilld.)蓮藕經(jīng)γ射線輻射處理，誘導(dǎo)出開花光照期縮短1 h的突變株[32]。近期，泰國育種者也在嘗試使用γ射線處理種藕和蓮子以選育荷花新奇品種[33-34]，國內(nèi)則開始摸索野生型蓮子的60Co-γ輻射效應(yīng)[35]。但由于輻射源、輻射操作和栽培方式等方面的差異，上述報(bào)道種藕或蓮子之間的輻射效應(yīng)差異較大，尤其無法確定60Co-γ對荷花野生型和現(xiàn)代優(yōu)良品種蓮子的半致死劑量差異。我國作為荷花的分布與栽培中心之一，保有大量的野生型種質(zhì)資源，培育品種達(dá)2 888個(gè)，占全球64.3%[36]。因此，明確荷花野生型和栽培品種蓮子對各種物理和化學(xué)誘變的響應(yīng)差異，以指導(dǎo)荷花的實(shí)踐育種，是充分利用我國荷花種質(zhì)資源、創(chuàng)制新種質(zhì)的途徑之一。

本研究以野生型微山紅以及50個(gè)栽培品種的蓮子為材料，通過60Co-γ輻射劑量先大跨度后小范圍的方式，篩選并確定兩類蓮子的半致死劑量，并對所得狹瓣變異單株進(jìn)行形態(tài)分析，旨在為γ射線誘導(dǎo)野生型和品種蓮子變異、選育荷花新種質(zhì)提供技術(shù)參考，為研究荷花的花被片發(fā)育和人工射線作用機(jī)制提供優(yōu)良材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用亞洲蓮的野生型和栽培品種兩類蓮子：野生型微山紅(N.nuciferaWeishan Hong)蓮子采自山東省微山湖的核心湖區(qū)(116°49′23″E，35°2′59″N)自然結(jié)實(shí)果實(shí)。栽培品種蓮子采自上海辰山植物園國際荷花資源圃(2016年國際睡蓮水景園藝協(xié)會International Waterlily &Water Gardening Society認(rèn)證)自然結(jié)實(shí)的果實(shí)，共選擇粉團(tuán)、巨子、單灑錦等50個(gè)品種，涉及白、粉、粉紅、紅、復(fù)色和灑錦共6種花色的單瓣和重瓣品種，以最大程度反映栽培品種的整體特性。

1.2 輻射處理步驟與方法

首先以微山紅蓮子為材料進(jìn)行60Co-γ半致死劑量(semi-lethal dose,LD50)初篩：2016年春季，在中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，使用人工60Co-γ射線輻射處理。設(shè)置20、40、80、160、320、500、750、1 000 Gy共8個(gè)劑量梯度，分別處理50、50、50、100、100、100、200和200粒微山紅蓮子，另選50粒作為對照組，不做輻射處理。將輻射處理后的蓮子破殼、浸水催芽。在催芽14和21 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)各輻射處理梯度下的萌芽率，然后定植于盆內(nèi)(直徑45 cm)，栽培管理期間多次觀察記錄、拍照，當(dāng)年秋季調(diào)查存活率，試驗(yàn)于上海市松江區(qū)新浜鎮(zhèn)荷花基地完成。2017年春季，根據(jù)上年存活率，縮小劑量范圍為150、160、170、180、200 Gy，以判定蓮子60Co-γ的LD50：每個(gè)梯度50粒微山紅蓮子和100粒栽培品種蓮子(50個(gè)品種，每個(gè)品種2粒，為輻射操作方便進(jìn)行混合)，兩者的對照分別為20和100粒。催芽后定植缸內(nèi)(直徑50 cm)，調(diào)查萌芽率、存活率以及形態(tài)變化。試驗(yàn)分別在上海辰山植物園和安徽省合肥植物園完成。萌芽率=綠色子葉伸出蓮殼的長度大于或等于蓮子自身長度狀態(tài)的蓮子數(shù)/被處理蓮子數(shù)×100%；存活率=實(shí)生苗生長至當(dāng)年立秋之后的植株數(shù)量/被處理蓮子萌芽數(shù)量(全部移栽)×100%。

1.3 半致死劑量的計(jì)算

使用SPSS 22.0軟件，以第二次輻射劑量0(CK)、150、160、170、180、200 Gy及其對應(yīng)存活率為基礎(chǔ)，擬合一元線性回歸方程Y=bX+a，并利用“回歸-線性”參數(shù)求算決定系數(shù)(R2)，以檢驗(yàn)方程的擬合優(yōu)度。其中，Y為植株存活率，X為輻射劑量；Y=50%時(shí)的X值即為半致死劑量(LD50)，Y=40%的X值為臨界劑量(LD40)。

1.4 變異植株主要性狀的測量

形態(tài)指標(biāo)以花朵和葉片表型為主?；ǘ湫誀钣诨ㄩ_第2天上午花朵完全打開時(shí)測量為準(zhǔn)，其中花被片長度為基部至頂端的距離，寬度為花被片最寬處距離，因花被片最外側(cè)第1～第6枚開花時(shí)易失水變形，為減小測量誤差，自第7～第8枚花被片開始測量?；ū黄瑪?shù)和雄蕊數(shù)：為防止外層花被(萼片狀)過早脫落，將出水后的花蕾套入網(wǎng)兜內(nèi)，開花前1～2 d采收統(tǒng)計(jì)。自交結(jié)實(shí)率：人工自花授粉結(jié)實(shí)后成熟花托內(nèi)飽滿果實(shí)數(shù)與其心皮(胚珠)數(shù)之比。利用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ輻射微山紅蓮子的半致死劑量范圍初篩

催芽14 d時(shí)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，500 Gy及更低劑量的蓮子萌芽率與對照組無差異，750和1 000 Gy劑量對應(yīng)的萌芽率小于對照(表1)。就錢葉生長勢而言，20 Gy處理的蓮子萌發(fā)錢葉數(shù)量與對照相似，40 Gy處理較對照生長旺盛，自80 Gy劑量起，蓮子的錢葉數(shù)量隨輻射劑量增加開始減少，至320 Gy劑量時(shí)差異明顯，750和1 000 Gy劑量處理組無展開錢葉(圖1)。同時(shí)，各劑量下蓮子的根系生長也表現(xiàn)出差異，80 Gy及更高劑量處理的蓮子根系長度及數(shù)量明顯小于對照(圖1)。

圖1 8個(gè)輻射劑量下微山紅蓮子的萌芽、差異(催芽14 d)Fig.1 Differences in germination of Weishan Hong seeds treated by eight doses of 60Co-γ when cultured in water for 14 days

在浸水催芽20 d時(shí)，750和1 000 Gy輻射蓮子分別出現(xiàn)3片和2片錢葉，且展開不完全。此時(shí)，將所有萌發(fā)蓮子定植于直徑45 cm塑料盆內(nèi)，每2周觀察1次生長情況。夏季7—8月份，多數(shù)存活的植株生長正常，部分表現(xiàn)出浮葉偏多、立葉偏少或葉柄直立性降低的現(xiàn)象(圖2-A)；常有葉片以葉臍為中心出現(xiàn)梭形痕跡且凹凸不平(圖2-B)，個(gè)別葉片的葉臍呈現(xiàn)粉紅色變化(圖2-C)。

立秋之后統(tǒng)計(jì)所有實(shí)生苗的存活狀況，發(fā)現(xiàn)20、40和80 Gy輻射劑量下的實(shí)生苗均100%存活，160 Gy劑量下存活率為67.0%，至320 Gy劑量時(shí)下降為38.9%，而1 000 Gy劑量下無植株存活(表1)。對野生型微山紅的蓮子而言，其60Co-γ的LD50在160～320 Gy之間。

表1 大輻射劑量跨度下微山紅蓮子的萌芽率和存活率變化Table 1 The germination rate and survival rate of Weishan Hong seedlings under a large span of irradiation doses

2.2 野生型和栽培品種蓮子半致死輻射劑量的確定

注:A:實(shí)生苗葉柄直立性降低;B:部分葉片呈現(xiàn)輕微褶皺;C:少量葉臍出現(xiàn)粉紅色。Note:A:The orthotropism of seedling petiole reduced.B:Slightly wrinkled leaves.C:Some of leaf navels displayed pink.圖2 輻射微山紅實(shí)生苗生長過程中的主要形態(tài)變化Fig.2 Main morphological changes during the growth of irradiated Weishan Hong seedlings

2017年4月在150～200 Gy的小劑量范圍內(nèi)，分別輻射微山紅和50個(gè)栽培品種混合蓮子，以獲得較為精確的荷花野生型和栽培品種的兩種類型蓮子在60Co-γ射線下的LD50。基于6個(gè)輻射梯度及其存活率(表2)，獲得微山紅為野生型荷花代表的線性回歸方程y=-0.260 7x+100.1(R2=0.983 8>0.8)，為極顯著相關(guān)，LD50為192 Gy；現(xiàn)代優(yōu)良栽培品種的線性回歸方程y=-0.285 2x+99.2(R2=0.984 1>0.8)，LD50為173 Gy，即栽培品種的蓮子對60Co-γ射線的耐受性略低于野生型的微山紅蓮。然而，在幼苗和成苗的形態(tài)上，兩者無顯著差異，均有類似大范圍劑量篩選時(shí)的葉柄扭曲、卷葉褶皺痕跡明顯等現(xiàn)象(圖2)。

表2 60Co-γ輻射對野生型和品種蓮子發(fā)育的影響Table 2 Effects of 60Co-γ irradiation on germination and seedling development of wild type and cultivars of lotus

2.3 輻射變異單株微山紅M652及其主要形態(tài)變化

蓮子經(jīng)過輻射處理后，當(dāng)年開花率降低，320 Gy及其以上高輻射劑量處理組表現(xiàn)更為顯著，即60Co-γ輻射處理干擾了荷花藕芽或花芽的分化和(或)發(fā)育能力。2017年夏季，在2016年80 Gy輻射劑量下存活的微山紅植株中，發(fā)現(xiàn)一株花被片變?yōu)楠M長形的特異單株(圖3)。經(jīng)2018—2019年連續(xù)蓮藕分株栽培觀測，花被片形態(tài)特征一致且穩(wěn)定，因此作為一個(gè)新品種命名為辰山飛燕，并完成蓮屬國際登錄。

與野生型微山紅相比(圖3-A、B、C)，變異辰山飛燕的主要形態(tài)特征為花蕾狹長和花被片狹長(圖3-D、E、F)?；ㄩ_2 d時(shí)，辰山飛燕的花被片寬長比均值為0.31，顯著小于野生型，但是兩者花被片的寬度和長度均值均無顯著差異(表3)。同時(shí)，辰山飛燕每朵花平均花被片數(shù)只有19.7(變化范圍18～22)，顯著低于野生型微山紅的23.2(變化范圍22～25)，其開花數(shù)量和立葉數(shù)量也顯著低于微山紅，并且無法自交結(jié)實(shí)(表3)。

雖然辰山飛燕的花被片更加狹長，但與野生型微山紅植株相比，其花開2 d時(shí)花朵的直徑×高度均值并未顯著增大，而其變幅在群體內(nèi)花朵之間增大(表3)，這源自辰山飛燕開花形態(tài)既有與野生型微山紅一致的碗狀，也常現(xiàn)收攏成杯狀和平展碟狀(圖3-F)，即其花態(tài)變化更加豐富。除花瓣形狀變化較大外，辰山飛燕的葉片也?，F(xiàn)緊密包裹狀或狹長魚鰭狀等畸形發(fā)育(圖3-G、H、I)，這種變化特征是荷花品種中極為少見的觀賞性狀之一。

表3 狹長瓣辰山飛燕和野生型微山紅主要表型差異Table 3 Major phenotypic differences between narrow-tepalled Chenshan Feiyan and wild-type Weishan Hong

注:A、B、C:野生型微山紅花蕾、花開1 d和2 d;D、E、F:辰山飛燕花蕾、花開1 d和2 d;G、H、I:辰山飛燕偶爾出現(xiàn)的畸形發(fā)育荷葉。Note:A,B,C:Bud,1 and 2 d flowers of wild Weishan Hong.D,E,F:Bud,1 and 2 d flowers of variant Chenshan Feiyan.G,H,I:Malformed leaves of Chenshan Feiyan.圖3 輻射所得變異辰山飛燕與其野生型的花朵和葉片形態(tài)差異Fig.3 Morphological differences in flowers and leaves of Chenshan Feiyan compared to its wild type

3 討論

3.1 蓮子的60Co-γ輻射劑量選擇

植物種子結(jié)構(gòu)與成分各不相同，使得60Co-γ射線的穿透效果不一。近20年，使用γ射線處理觀賞植物種子的報(bào)道中，多數(shù)的劑量范圍為0～500 Gy[4,16]。蓮子作為荷花的果實(shí)，本質(zhì)是一種堅(jiān)果，其果殼不僅厚實(shí)堅(jiān)硬且物化性質(zhì)獨(dú)特[37-38]。因此，本研究在初始輻射處理時(shí)設(shè)置了超過常規(guī)劑量范圍的750和1 000 Gy，以較為全面地檢測60Co-γ射線對蓮子的輻射效應(yīng)：在這2個(gè)高劑量處理下，蓮子催芽后葉柄可正常生長且有極少量錢葉展開，暗示相比其他多數(shù)植物的種子[4]，蓮子對60Co-γ射線的耐受性較高。

3.2 野生型和栽培品種蓮子對60Co-γ耐受性(半致死劑量)差異

LD50是衡量植物材料對物理射線耐受性的指標(biāo)之一，在實(shí)踐中常被選做適宜的輻射處理劑量。然而，由于植物材料本身(例如種子的物化性質(zhì)、成熟度等)、輻射源本身(半衰期)以及操作方式(輻射源距離、材料擺放方式)等方面的差異，致使同一種植物材料在不同輻射處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出不同的輻射效果。在早期的蓮子輻射試驗(yàn)中，檢測到20個(gè)荷花品種蓮子對60Co-γ射線的LD50為50 Gy左右，并建議其適宜誘變劑量為30～60 Gy[30]；近期對野生型荷花資源微山紅和黑龍江紅輻射處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，其蓮子的LD50分別為125和160 Gy[35]，泰國本土品種Pathum蓮子的LD50可達(dá)28 Krad(280 Gy)[34]。由此可見，荷花野生型和栽培品種兩類蓮子對60Co-γ射線的耐受性存在差異，但此差異的相對量尚未明確。在相同輻射處理與栽培條件下，本研究確定了野生型荷花微山紅和50個(gè)現(xiàn)代品種蓮子的LD50分別為192和173 Gy，即兩者對60Co-γ射線的耐受性相差19 Gy。若將60Co-γ射線可能對蓮子胚因輻射直接致死而未萌芽的因素考慮在內(nèi)，計(jì)算出微山紅與栽培品種的LD50分別為198和162 Gy。因此，基于蓮子和輻射源本身的差異，結(jié)合臨界劑量(LD40)，建議今后使用野生型(以及遺傳背景相對單一的地方傳統(tǒng)品種)和20世紀(jì)以來選育的現(xiàn)代品種的蓮子進(jìn)行輻射育種或誘變突變體時(shí)，輻射劑量可分別在150～200 Gy和130～180 Gy范圍內(nèi)選擇。然而，目前同一條件下使用60Co-γ輻射處理野生蓮和品種蓮子開展比較分析尚無其他報(bào)道，因此，上述推薦輻射劑量范圍的參考價(jià)值有待進(jìn)一步重復(fù)試驗(yàn)從而進(jìn)行驗(yàn)證與評價(jià)。

3.3 60Co-γ射線對荷花生長與形態(tài)的主要影響

在荷花7個(gè)物理射線育種報(bào)道中，無論研究對象為組培苗、種藕或蓮子，其幼苗及植株對γ射線響應(yīng)最突出的均為葉柄和葉片的異?；蚧伟l(fā)育，而花朵各部分變異較少或不顯著[31,34-35]。推測其主要原因：一是幼苗生長過程中，其強(qiáng)大的自我修復(fù)能力使得輻射損傷逐漸削弱，使得后續(xù)新生芽點(diǎn)發(fā)育逐步恢復(fù)正常[39]；其二，在觀賞植物中，利用60Co-γ輻射選育新奇品種，目前總體效果較好但比例低，即被處理植物材料需要在數(shù)量上得到一定保證，才有機(jī)會獲得目標(biāo)性狀。本研究中輻射蓮子的幼苗多數(shù)表現(xiàn)出葉柄瘦弱、彎曲或扭曲以及成活植株的立葉少等現(xiàn)象，但在后續(xù)2年的生長周期中，此現(xiàn)象逐漸減少；在輻射的1 650粒(微山紅900粒+250粒，栽培品種500粒)蓮子中，僅獲得1個(gè)變異株，培育成性狀穩(wěn)定的新品種辰山飛燕，此結(jié)果再次輔證了以上推測。

4 結(jié)論

野生型微山紅和栽培品種的蓮子對60Co-γ射線的耐受性存在一定差異，兩者的LD50分別為192和173 Gy，建議今后輻射育種時(shí)處理野生蓮和栽培品種蓮子的劑量分別選擇150～200 Gy和130～180 Gy。由狹長花被片變異株育成的辰山飛燕，為今后培育類似菊瓣等極端瓣形的荷花新奇品種和研究植物花被片形狀的遺傳發(fā)育機(jī)制提供了良好的材料。