張文萍， 張仲明， 羅燕婷， 楊燕梅， 余志勇， 曲久鑫

[深圳市第三人民醫(yī)院（南方科技大學(xué)附屬第二醫(yī)院）檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518114]

細(xì)菌性感染是臨床常見的感染性疾病之一，嚴(yán)重細(xì)菌性感染導(dǎo)致的膿毒癥是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一[1]。不同性質(zhì)的感染臨床治療方法不同，故臨床實(shí)驗(yàn)室快速鑒別病原菌意義重大[2]。目前，臨床對細(xì)菌性感染的確診主要根據(jù)微生物培養(yǎng)結(jié)果，但該法陽性率和準(zhǔn)確性受標(biāo)本采集等因素影響較大，且耗時長，一般需3～4 d，無法滿足急診危重患者的救治需求[3]。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室迫切需要尋找成本較低，能準(zhǔn)確診斷感染程度的指標(biāo)。

有研究結(jié)果表明，中毒顆粒、空泡、杜勒小體等中性粒細(xì)胞形態(tài)改變對診斷急性細(xì)菌感染有較大價值[3-4]，聯(lián)合中性粒細(xì)胞絕對值、桿狀核粒細(xì)胞比例可提高診斷細(xì)菌感染性疾病的敏感性[5]。雖然顯微鏡下中性粒細(xì)胞形態(tài)改變（中毒顆粒、空泡、杜勒小體）一直是判斷患者細(xì)菌感染程度的參考，但因無統(tǒng)一識別標(biāo)準(zhǔn)，且檢測結(jié)果受檢測人員主觀因素和染色因素影響，難以標(biāo)準(zhǔn)化[6-8]，大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室未常規(guī)開展，只有在鏡檢發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重中毒顆粒存在時，才作為細(xì)菌感染的佐證告知臨床，而臨床醫(yī)生在進(jìn)行疾病診療時往往希望有更多證據(jù)提示患者感狀情況，尤其是能在疾病發(fā)展早期給出標(biāo)準(zhǔn)的量化提示。本研究擬建立定量檢測外周血中性粒細(xì)胞中毒顆粒的方法，以指導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室對患者外周血中的中毒顆粒進(jìn)行準(zhǔn)確的定量識別，明確染色因素對中毒顆粒鏡下識別結(jié)果的影響，以及中毒顆粒在鑒別細(xì)菌性感染中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選取深圳市第三人民醫(yī)院感染科、呼吸內(nèi)科等診斷明確的62例細(xì)菌感染患者（感染組），其中男36例、女26例，年齡18～87歲；以同期50名體檢健康者作為正常對照組，其中男21名、女29名，年齡24～64歲。

1.2 方法

參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，結(jié)合不同臨床實(shí)驗(yàn)室對中毒顆粒識別的方法，建立中毒顆粒鏡下人工定量方法。（1）中毒顆粒與疾病的關(guān)系。收集所有研究對象就診時的乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血樣本，為消除制片和染色過程中操作誤差的干擾，統(tǒng)一使用SC-120全自動推染片機(jī)（深圳邁瑞公司），在默認(rèn)染色[瑞氏-吉姆薩染液（珠海Baso公司）]條件下制備標(biāo)準(zhǔn)化外周血涂片（每例樣本制備2張血涂片），由2名有豐富閱片經(jīng)驗(yàn)的技師對血涂片進(jìn)行鏡檢，計(jì)數(shù)100個中性粒細(xì)胞，并根據(jù)制定的規(guī)則對每個中性粒細(xì)胞中毒顆粒程度進(jìn)行分級，計(jì)算中毒顆粒定量參數(shù)；（2）染色條件的影響。隨機(jī)挑選3例感染科患者樣本和2例體檢者樣本，每例樣本用推染片機(jī)制備10張不同染色條件的血涂片（表1），分為5組，每組2張，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)人員對血涂片進(jìn)行鏡檢；按照制定的規(guī)則計(jì)算各組血涂片中毒顆粒定量結(jié)果；以正常染色條件（C組）下的結(jié)果作為參考值，其他染色條件（A、B、D、E組，表1）下的結(jié)果作為實(shí)驗(yàn)組結(jié)果，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組中毒顆粒鏡檢結(jié)果與參考值的偏差，然后以樣本編號作為橫坐標(biāo)，以不同染色條件下的結(jié)果的偏差作為縱坐標(biāo)繪制結(jié)果偏差圖。

表1 染色時間與染色比例選擇及血涂片染色數(shù)量

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.4.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估中毒指數(shù)和中毒積分診斷細(xì)菌感染性疾病的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中毒顆粒鏡檢定量方法

中毒顆粒鏡檢定量方法以中毒指數(shù)和/或中毒積分表示。（1）油鏡下計(jì)數(shù)100個中性粒細(xì)胞，計(jì)算中毒指數(shù)，計(jì)算公式為：中毒指數(shù)=含中毒顆粒的中性粒細(xì)胞/[所有計(jì)數(shù)的中性粒細(xì)胞數(shù)（通常為100或200個）]×100%。（2）計(jì)數(shù)100個中性粒細(xì)胞，并按分級方法（表2、圖1）對每個中性粒細(xì)胞中毒顆粒情況進(jìn)行計(jì)分，計(jì)算中毒積分（100個中性粒細(xì)胞的積分總和），計(jì)算公式為：中毒積分=∑（Ni×Si）/∑Ni×100，式中i表示含中毒顆粒的中性粒細(xì)胞的等級（分別為0、1、2、3、4級），N表示每個等級中性粒細(xì)胞的數(shù)量，S表示每個等級所對應(yīng)的中毒積分（分別為0、1、2、3、4分）。

表2 單個中性粒細(xì)胞中毒顆粒分級標(biāo)準(zhǔn)

圖1 各級含中毒顆粒中性粒細(xì)胞顯微鏡下形態(tài)

2.2 不同染色條件下中性粒細(xì)胞中毒顆粒著色情況及定量結(jié)果比較

不同染色條件下中性粒細(xì)胞中毒顆粒著色情況見圖2，中毒指數(shù)和中毒積分與參考值結(jié)果的絕對偏差見圖3。其中樣本3和5為對照組，樣本1、2、4為感染組；A組樣本中毒顆粒定量結(jié)果顯著低于C組（參考值），提示中毒顆粒未完全著色，導(dǎo)致人工鏡下識別假陰性；B組中毒顆粒定量結(jié)果偏差不一，提示該染色條件下中毒顆粒著色不一，導(dǎo)致人工識別存在較大主觀誤差；D、E組樣本中毒顆粒定量結(jié)果顯著高于C組（參考值），提示中毒顆粒著色過深，導(dǎo)致人工鏡下識別假陽性。

圖2 不同染色條件下中性粒細(xì)胞中毒顆粒著色情況

圖3 不同染色條件下中毒指數(shù)和中毒積分定量結(jié)果偏差圖

2.3 細(xì)菌感染組與正常對照組中毒指數(shù)、中毒積分比較

細(xì)菌感染組中毒指數(shù)為48.7（22.2～84.5）%中毒積分為58.0（12.0～131.1）分，均顯著高于正常對照組[2.0（1.0～5.0）%、2（1～5）分]（Z值分別為-8.64、-3.46，P＜0.000 1。

2.4 中毒指數(shù)與中毒積分診斷細(xì)菌感染的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，中毒指數(shù)和中毒積分診斷細(xì)菌感染的曲線下面積（95%可信區(qū)間）分別為0.921（0.862～0.980）和0.900（0.838～0.963），最佳臨界值分別為6%、6分，敏感性分別為88.7%和83.9%，特異性分別為86.0%和86.0%。見圖4。

圖4 中毒指數(shù)與中毒積分診斷細(xì)菌感染性疾病的ROC曲線

2.5 中毒指數(shù)與中毒積分的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，中毒指數(shù)和中毒積分呈正相關(guān)（r2=0.89），在正常對照者或輕度感染患者中，2個指標(biāo)結(jié)果一致性較好，但中毒顆粒分級較高時，中毒積分較中毒指數(shù)有更寬的檢測范圍。見圖5。

圖5 中毒指數(shù)與中毒積分的相關(guān)性

3 討論

中毒顆粒是中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中比正常中性顆粒粗大、大小不等、呈黑色或紫黑色的顆粒[9]，實(shí)際上是特殊中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒，其在早幼粒細(xì)胞階段形成，并在中性粒細(xì)胞中成熟，含有效抗菌成分[10-11]。當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重細(xì)菌感染時，粒細(xì)胞集落刺激因子被激活，大量未成熟粒細(xì)胞被釋放入外周血，嗜苯胺藍(lán)顆粒中的酸性黏液物質(zhì)不斷增多，最終形成中性粒細(xì)胞中毒顆粒，中毒顆粒在pH值為5.5～7.3時能有效增強(qiáng)滅菌活性[10-11]。當(dāng)患者被細(xì)菌感染時，中毒顆粒是中性粒細(xì)胞形態(tài)改變的特征之一，通過觀察中性粒細(xì)胞中毒顆粒程度，對細(xì)菌感染有較好的提示作用[10-11]。

人工鏡檢是目前中毒顆粒唯一的檢測方法，能直觀地捕捉到細(xì)胞被攻擊的情況和人體抵抗的狀態(tài)。但在樣本量巨大、檢驗(yàn)項(xiàng)目眾多的臨床實(shí)驗(yàn)室，采用傳統(tǒng)的人工鏡檢方法檢測中毒顆粒存在一定困難，對檢測人員要求較高，且中毒顆粒易與嗜堿性顆?；煜?，中毒顆粒量化無統(tǒng)一識別標(biāo)準(zhǔn)，不同檢測人員主觀判斷不一致，因此限制了該項(xiàng)目的廣泛應(yīng)用[5]。

有學(xué)者建議以中毒指數(shù)對中毒顆粒進(jìn)行定量，但該方法只有中毒顆粒中性粒細(xì)胞比例，未對單個中性粒細(xì)胞中毒顆粒程度進(jìn)行準(zhǔn)確分級[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在中毒指數(shù)＞80%的區(qū)域內(nèi)，中毒指數(shù)上升趨勢明顯下降，不能很好地反映中毒顆粒數(shù)量與大小，而中毒積分相對于中毒指數(shù)在整個區(qū)域內(nèi)均有良好的上升趨勢，有更寬的檢測范圍，在中毒顆粒較多的情況下，可更準(zhǔn)確地反映中毒顆粒數(shù)量。本研究建立的分級和積分計(jì)算方法根據(jù)中毒顆粒大小、數(shù)量和密度進(jìn)行分級，并給出對應(yīng)參考圖示，可更好地幫助檢測人員進(jìn)行中毒顆粒分級和積分計(jì)算，與臨床實(shí)驗(yàn)室開展中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色定量方法類似，實(shí)驗(yàn)室工作人員更易接受。

本研究結(jié)果表明，中毒顆粒定量結(jié)果與血涂片染色質(zhì)量關(guān)系較大，在染色偏堿或染色時間過長時，正常中性粒細(xì)胞的顆粒會著色加深，導(dǎo)致中毒顆粒假陽性；在染色偏酸或染色時間不足時，中毒顆粒著色偏淺，可能無法被準(zhǔn)確地識別，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，建議臨床實(shí)驗(yàn)室使用固定染色條件下的推染片機(jī)統(tǒng)一制備標(biāo)準(zhǔn)的外周血涂片，然后再進(jìn)行中毒顆粒的人工鏡檢，以消除人工操作帶來的誤差。本研究使用的全自動推染片機(jī)，其默認(rèn)染液和緩沖液的比例是2∶18，染色時間為瑞氏-吉姆薩染液A液染色1 min，A和B混合液染色4 min，具有良好的染色效果。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，全自動推染片機(jī)在默認(rèn)染色條件下制備的標(biāo)準(zhǔn)血涂片優(yōu)于傳統(tǒng)手工涂片染色[13-15]，故以正常染色情況（C組）下的結(jié)果作為參考值，本研究結(jié)果可供其他臨床實(shí)驗(yàn)室參考。

相關(guān)研究結(jié)果已證實(shí)細(xì)菌感染性疾病與中毒顆粒有關(guān)[13-15]。本研究結(jié)果顯示，細(xì)菌感染組中毒指數(shù)和中毒積分分別為48.7（22.2～84.5）%和58.0（12.0～131.1）分，均顯著高于正常對照組[2.0（1.0～5.0）%和2（1～5）分，P＜0.000 1]；此外，中毒指數(shù)和中毒積分診斷細(xì)菌感染性疾病的曲線下面積分別為0.921和0.900，提示本研究所建立的中毒顆粒人工鏡檢定量方法能有效反映患者細(xì)菌感染的情況，完全可以作為指示患者細(xì)菌感染的良好指標(biāo)。由于人工鏡檢的工作量較大，本研究并未將病毒感染患者、膿毒癥患者納入統(tǒng)計(jì)，后續(xù)的研究將納入此類病例樣本，分析中毒顆粒在細(xì)菌和病毒感染的鑒別診斷、細(xì)菌感染和膿毒癥的鑒別診斷中的價值。