俞 瑩， 李建杰， 李漢華， 黃 娟， 翁文浩， 陳學飛

（同濟大學附屬楊浦醫(yī)院檢驗科，上海 200090）

前列腺癌是男性最常見的癌癥之一，在美國男性癌癥相關死亡中居第2位[1]。隨著我國人口老齡化的發(fā)展，前列腺癌的發(fā)病率逐年升高[2]。盡管雄激素剝奪療法、放療和外科手術在前列腺癌的臨床治療方面取得了一定的進展，但前列腺癌的發(fā)病率和死亡率仍較高[3]。目前，靶向治療作為前列腺癌的一種重要且有效的治療策略受到越來越多的關注。了解前列腺癌進展的分子基礎可為前列腺癌的治療提供新的策略。微小RNA（microRNA，miR）是一類由21～24個核苷酸組成的高度保守的非編碼單鏈RNA，在癌細胞增殖、分化、侵襲和轉移等一系列生物學過程發(fā)揮著重要的調控作用，被視為腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要參與者。有研究結果顯示，微小RNA-4429（microRNA-4429，miR-4429）與宮頸癌[4]、多形性膠質母細胞瘤[5]、胃癌[6]以及甲狀腺乳頭狀癌[7]有關，主要起抑癌作用，但在前列腺癌中的作用尚未見報道。異黏蛋白（metadherin，MTDH）被發(fā)現(xiàn)在神經膠質瘤[8]等多種腫瘤中呈高表達。miRNA靶標預測分析結果顯示，miR-4429與MTDH的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）存在靶向結合位點[9]。本研究擬探討miR-4429在前列腺癌細胞系中相對表達量的變化及其對癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑

miR-4429模擬物（miR-4429 mimic）、miR-4429抑制物（miR-4429 inhibitor）、模擬物陰性對照（mimic NC）和抑制物陰性對照（inhibitor NC）購自上海吉瑪制藥公司。Trizol試劑、RNA逆轉錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒（miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix）購自南京諾唯贊生物科技有限公司。兔抗MTDH單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔（鼠）IgG抗體及Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司。CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。Transwell小室（8 μm）和Matrigel基質膠購自美國Corning公司。pmirGLO熒光素酶報告載體及MTDH過表達載體的構建由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司完成。

1.2 細胞來源和培養(yǎng)

人前列腺癌細胞系DU145、22rv1、PC3、LNCaP、VCaP和人前列腺上皮細胞系RWPE-1均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。RWPE-1細胞采用含L-谷氨酰胺的F12K細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）培養(yǎng)；DU145、PC3、LNCaP、22rv1細胞均采用RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）培養(yǎng)，VCaP細胞采用Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均補充青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L和10%胎牛血清。所有細胞放置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR檢測miR-4429及MTDH的相對表達量

按TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA，RNA純度和濃度測定合格后，使用逆轉錄試劑盒合成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。以cDNA為模板，分別按照miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書配置miR-4429及MTDH反應體系，反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸25 s，共40個循環(huán)。檢測儀器為ABI 7900實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。miR-4429以U6作為內參基因，MTDH以GAPDH作為內參基因。miR-4429上游引物為5′-CGCGAAAAGCTGGGCTGA-3′，下游引物為5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；MTDH上游引物為5′-TGTTGAAGTGGCTGAGGG-3′，下游引物為5′-CAGGAAATGATGCGGTTG-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，GAPDH上游引物為5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，下游引物為5′-TGTCCCGGCAGAATTTCC-3′，根據2-ΔΔCt法計算miRNA-4429和MTDH的相對表達量。

1.4 細胞轉染

將PC3細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細胞融合度達60%～70%時進行細胞轉染。按Lipofectamine 2000說明書分別將miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC轉染至PC3細胞，轉染24 h后，采用RT-qPCR檢測miR-4429的相對表達量，確定轉染效率。

1.5 細胞增殖能力檢測

采用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖能力。收集轉染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、陰性對照mimic NC和inhibitor NC的PC3細胞，按2 000個細胞/孔的密度分別接種于96孔板，每組設置6個復孔，每孔加入10 μL CCK-8反應液，37 ℃孵育，接種細胞后12、24、36、48、60 h，通過Multiskan Sky全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）測定450 nm波長處各孔不同時間點的吸光度（A）值，繪制增殖曲線。

1.6 集落形成試驗

收集轉染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC的PC3細胞，收集轉染mimic NC、miR-4429 mimic、過表達空載質粒（Vector）、MTDH過表達質粒（MTDH OE）以及共轉染miR-4429 mimic和MTDH過表達質粒（MTDH OE+miR-4429 mimic）的PC3細胞，按2×103個細胞/孔的密度加到6孔板中，再加入新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基，2 d更換1次，培養(yǎng)14 d后棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定20 min，棄去固定液，加2 mL結晶紫染液，染色30 min，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗滌后干燥30 min，拍照后用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）計數細胞克隆數。

1.7 細胞遷移能力檢測

收集轉染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC的PC3細胞，收集轉染mimic NC、Vector、miR-4429 mimic、MDTH OE以及共轉染miR-4429 mimic和MDTH OE的PC3細胞，使用RPMI 1640無血清培養(yǎng)基重懸PC3細胞，并調整細胞密度至5×105/mL，將200 μL PC3細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600 μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦棄小室上層的細胞，用4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色1 h，PBS洗滌，在CKX-53型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下隨機選5個高倍鏡視野拍照，并進行細胞計數。

1.8 基質膠侵襲試驗

將基質膠均勻鋪于Transwell小室上室并過夜成膜。收集轉染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC的PC3細胞，收集轉染mimic NC、Vector、miR-4429 mimic、MDTH OE以及共轉染miR-4429 mimic和MDTH OE的PC3細胞，并用RPMI 1640無血清培養(yǎng)基重懸，制備單細胞懸液，取1×105個細胞的細胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入600 μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后用棉簽輕輕擦棄小室上層的細胞，用4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色1 h，PBS洗滌，在CKX-53型顯微鏡下隨機選5個高倍鏡視野拍照，并進行細胞計數。

1.9 靶基因預測

采用TargetScan 7.0數據庫（ http：//www.targetscan.org/vert_72/）和miRanda數據庫（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）對miR-4429的靶基因進行預測，綜合分析選取具有代表性的靶基因進行靶點驗證。

1.10 熒光素酶報告基因分析

將野生型或突變型（突變M T D H與miRNA-4429結合位點）的MTDH3′UTR片段分別克隆到pmir GLO熒光素酶報告載體中。MTDH3′UTR-野生型和MTDH3′UTR -突變型熒光素酶報告基因質粒和內參質粒[海腎熒光素酶（Renilla luciferase，Rluc）]分別與miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC或inhibitor NC共轉染。48 h后按照Dual Luciferase Reporter Assay System說明書進行操作，使用Promega GloMax 20/20發(fā)光檢測儀（美國Promega生物公司）對螢火蟲熒光值和Rluc熒光值進行測定。以Rluc熒光作為內參對各組測定結果進行均一化處理。以螢火蟲熒光值/Rluc熒光值的比值作為目的熒光素酶報告基因的相對熒光素酶活性。

1.11 MTDH蛋白相對表達量檢測

收集RWPE-1細胞和PC3細胞，收集轉染miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC的PC3細胞，收集轉染mimic NC、Vector、miR-4429 mimic、MDTH OE以及共轉染miR-4429 mimic和MDTH OE的PC3細胞，使用RIPA裂解液（含5%蛋白酶抑制劑）（北京索萊寶科技有限公司）提取總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定各組的蛋白質濃度。每個樣本的蛋白上樣量為40 μg，采用10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）進一步分離蛋白，通過濕轉法將產物轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%封閉液封閉1 h后，使用三羥甲基氨基甲烷-吐溫（tris-hydroxymethyl aminoethane-Tween，TBST）緩沖液洗3遍，每次10 min，加入一抗MTDH（1∶500）和GAPDH（1∶1 000），置于4 ℃搖床孵育過夜，TBST緩沖液洗3遍，每次10 min，分別加入HRP標記的羊抗兔IgG和HRP標記的羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h后使用ECL顯影液顯影，采用Tanon-4100全自動數碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）進行成像分析。采用Image J軟件對條帶進行灰度統(tǒng)計。

1.12 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有試驗均獨立重復3次。呈正態(tài)分布的數據以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同人前列腺癌細胞系中miR-4429的相對表達量和miR-4429的轉染效率

人前列腺癌細胞系DU145、22rv1、PC3、LNCaP和VCaP的miR-4429相對表達量顯著均低于人前列腺上皮細胞系RWPE-1（P＜0.05），其中PC3細胞miR-4429相對表達量降低最為顯著（P＜0.01），見圖1。因此，細胞轉染試驗以PC3細胞為研究對象。

圖1 不同人前列腺癌細胞系和人前列腺上皮細胞系RWPE-1中miR-4429的相對表達量

將miR-4429 mimic、miR-4429 inhibitor、mimic NC和inhibitor NC分別轉染至PC3細胞中。miR-4429 mimic組（過表達miR-4429）miR-4429相對表達量明顯高于mimic NC組（P＜0.01）。miR-4429 inhibitor組（抑制miR-4429表達）miR-4429相對表達量顯著低于inhibitor NC組（P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組miR-4429相對表達量比較

2.2 miR-4429對PC3細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

培養(yǎng)48和60 h時，miR-4429 mimic組PC3細胞的增殖能力明顯低于mimic NC組（P＜0.01）；miR-4429 inhibitor組的增殖能力顯著高于inhibitor NC組（P＜0.01）；見圖3（a）。miR-4429 mimic組細胞克隆形成數目明顯低于mimic NC組，而miR-4429 inhibitor組細胞克隆形成數目高于inhibitor NC組，見圖3（b）。遷移試驗結果顯示，miR-4429 mimic組PC3細胞遷移數目明顯低于mimic NC組（P＜0.01）；而miR-4429 inhibitor組PC3細胞遷移數目明顯高于inhibitor NC組（P＜0.01）；見圖3（c）、圖3（d）。侵襲試驗結果顯示，miR-4429 mimic組侵襲細胞數目低于mimic NC組（P＜0.01）；miR-4429 inhibitor組侵襲細胞數目高于inhibitor NC組（P＜0.01） ；見圖3（e）和圖3（f）。

圖3 miR-4429對PC3細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

2.3 miR-4429靶基因的預測結果

生物信息學軟件預測結果顯示，MTDH可能是miR-4429作用的靶基因。miR-4429與MTDH的3′UTR區(qū)序列互補的結合位點見圖4（a）。熒光素酶報告基因試驗結果顯示，在MTDH3′UTR-野生型中，miR-4429 mimic組熒光素酶活性顯著低于mimic NC組（P＜0.01）；miR-4429 inhibitor組熒光素酶活性顯著高于inhibitor NC組（P＜0.01）。在MTDH3′UTR-突變型中，無論轉染miR-4429 mimic還是miR-4429 inhibitor，其熒光素酶活性均無明顯變化（P＞0.05）。見圖4（b）。

圖4 miR-4429與MTDH的結合點及熒光素酶報告基因試驗結果

2.4 miR-4429對MTDH表達的影響

PC3細胞MTDHmRNA和蛋白的相對表達量顯著高于RWPE-1細胞（P＜0.01），見圖5（a）和圖5（b）。在PC3細胞中，miR-4429 mimic組MTDHmRNA和蛋白的相對表達量顯著低于mimic NC組（P＜0.01）；miR-4429 inhibitor組MTDHmRNA和蛋白的相對表達量顯著高于inhibitor NC組（P＜0.01）；見圖5（c）和圖5（d）。

圖5 miR-4429對MTDH mRNA和MTDH蛋白表達的影響

2.5 過表達MTDH對PC3細胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-4429 mimic組克隆形成數目、MTDH蛋白的相對表達量、遷移和侵襲細胞數目低于mimic NC組。MTDH OE組克隆形成數目、MTDH蛋白的相對表達量、遷移和侵襲細胞數目高于Vector組（P＜0.01）。MTDH OE+miR-4429 mimic組的克隆形成數目、MTDH蛋白的相對表達量、遷移和侵襲細胞數目均高于miR-4429 mimic組（P＜0.01）。見圖6。

圖6 過表達miR-4429或MTDH對PC3細胞增殖，遷移和侵襲的影響

3 討論

目前，前列腺癌發(fā)生的原因和機制尚未被完全闡明。探討前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找新的治療靶點，對于延緩前列腺癌的發(fā)展，提高前列腺癌患者生存率有重要意義。miRNA在腫瘤細胞增殖、遷移、分化、侵襲和耐藥等一系列生物學進程中扮演著重要的角色。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-4429通過靶向DNA損傷修復的關鍵因子RAD51，提高了宮頸癌細胞對放療的敏感性[5]；還可通過靶向CDK6，抑制腎透明細胞癌的進展和上皮-間質轉化[10]。血清miRNA微陣列分析結果顯示，hsa-miR-4429通過調控靶基因在膽道閉鎖進程中發(fā)揮重要作用，或可作為診斷膽道閉鎖的生物標志物[11]。急性缺血性卒中患者miR-4429表達量顯著降低，參與調節(jié)免疫細胞基因的表達[12]。miR-4429在宮頸癌組織和細胞中呈低表達，起抑癌作用[13]。本研究結果顯示，miR-4429在前列腺癌細胞中呈低表達，PC3細胞的表達量最低，miR-4429過表達可顯著抑制PC3細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而抑制miR-4429表達則可促進PC3細胞的增殖、遷移和侵襲。這些結果說明miR-4429可以抑制前列腺癌細胞增殖，遷移和侵襲。因此，miR-4429在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起抑制作用。

有研究結果表明，MTDH是一種促癌基因，且受多種miRNA的調節(jié)。MTDH可通過激活葡萄球菌核酸酶結構域包含蛋白1（staphylococcal nulcease domain containing 1，SND1）介導的細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信號通路和上皮-間質轉化，促進腎透明細胞癌的轉移[14]。敲除MTDH可降低卵巢癌細胞的增殖、轉移能力[15]。由此可見，MTDH具有致癌作用，可作為抗腫瘤治療的靶點。在結直腸癌中，MTDH是miR-182-5p的功能靶點，miR-182-5p靶向MTDH可抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移[16]。有研究結果顯示，miR-154可通過抑制MTDH的表達來抑制胃癌細胞的增殖[17]。本研究采用熒光素酶報告基因試驗驗證了miR-4429靶向結合MTDH，并且miR-4429的過表達可顯著抑制MTDH的轉錄和蛋白表達。將miR-4429 mimic和MTDH共轉染PC3細胞，結果顯示，miR-4429對PC3細胞的增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用被逆轉。提示miR-4429的下調可能會促進MTDH表達，進而促進前列腺癌的發(fā)展。

綜上所述，miR-4429可抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移與侵襲，其作用機制與靶向負調控MTDH的表達有關。