武彩霞，李傳厚，劉曉金，張曉明

(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000)

匹諾塞林屬于黃酮類化合物，蜂膠中含量較高，是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的一種新型腦保護新藥，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床研究階段[1]。研究證實，該藥治療腦缺血再灌注損傷與抗氧化、抗炎、抗凋亡、血管舒張等多方面的作用有關(guān)[2-4]，但作用靶點仍然不清楚。研究顯示，腦缺血再灌注后可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)發(fā)生，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯水平下降和誘發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。為探討匹諾塞林腦保護的作用機制是否與減少ERS凋亡有關(guān)，本研究用缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷SH-SY5Y細(xì)胞模擬腦缺血再灌注損傷模型，檢測匹諾塞林對細(xì)胞凋亡和ERS凋亡通路PERK-eIF2α-CHOP/GADD153相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以期為尋找其作用靶點提供啟示。

1 材料與方法

1.1材料 藥品與試劑：匹諾塞林凍干粉(批號201704)；SH-SY5Y細(xì)胞株(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所)；DMEM/F12培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(均購自Gibco公司)；胰蛋白酶、L-谷氨酸、Hochest 33258、噻唑藍(lán)(MTT)，均購自Sigma公司；乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；鈣離子熒光探針Fura-4/AM(Invitrogin公司)；一抗：GRP78、CHOP、ATF4、P-eIF2α(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；Dylight651-conjugated 熒光二抗(美國CST公司)。主要儀器設(shè)備：細(xì)胞孵育箱(日本三洋公司)，超凈純水儀(美國Beckman公司)，熒光顯微鏡IX71(日本Olympus公司)，Spectra Max M5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，高內(nèi)涵細(xì)胞成像儀(英國Thermo Fisher公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞在DMEM/F12基質(zhì)中培養(yǎng)，細(xì)胞呈對數(shù)增長時，接種在96孔培養(yǎng)板中(或接種于25 cm2培養(yǎng)瓶)，24 h后更換無糖EBSS平衡鹽溶液，將其隨機分為5組：對照組，更換完全培養(yǎng)基，正常條件下培養(yǎng)；缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷組(OGD/R)，不加任何藥物；匹諾塞林0.01、0.1、1μM三個劑量組。除對照組外，其他各組分別于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、1%O2、94%N2，培養(yǎng)2 h后移除培養(yǎng)液，更換完全培養(yǎng)基，復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)12 h。每組細(xì)胞6孔，實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)分別處理。

1.2.2匹諾塞林對細(xì)胞活力及LDH的影響 96孔板細(xì)胞加入藥物處理培養(yǎng)12 h后吸出培養(yǎng)液，加入無血清的培養(yǎng)基配制的MTT，終濃度為0.5 mg/mL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后移走M(jìn)TT，每孔加入DMSO 150 μL，溶解，振蕩后于Spectra Max M5酶標(biāo)儀570 nm處測定吸光度OD值。以對照組細(xì)胞存活率為100%，計算不同處理組細(xì)胞的存活率。細(xì)胞活力計算如下：Viability(%)=[(OD給藥組-OD損傷組)/OD損傷組]×100%；細(xì)胞釋放LDH的測定按照試劑盒說明書操作。

1.2.3匹諾塞林對細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞核Hoechest33324染色，觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)：96孔板藥物處理12 h后，吸除培養(yǎng)基，PBS洗滌后加入含Hoechst33342的培養(yǎng)基(終濃度1μg/mL)，37℃避光孵育10 min，再用PBS洗滌，高內(nèi)涵拍照分析。細(xì)胞凋亡率：藥物處理12 h后，按照試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4匹諾塞林對ERS途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 96孔板細(xì)胞藥物處理12 h后，PBS洗滌細(xì)胞；預(yù)溫的4%多聚甲醛固定20 min后，吸除固定液，PBS洗滌；0.5% Triton X-100/PBS室溫孵育10 min，吸除Triton X-100/PBS，PBS洗滌；2%BSA/PBS 37℃孵育60 min，吸除封閉液，加入實驗所需一抗50μL(1∶200)4℃孵育過夜；吸除一抗，PBS洗滌，加入Dylight495-conjugated羊抗兔熒光二抗50μL(1∶500)或Dylight651-conjugated驢抗羊熒光二抗50μL(1∶200)，37℃避光孵育2 h；吸除二抗，PBS洗滌2次后，加入Hochest(終濃度5μg/mL)，37℃避光孵育10 min；棄去上清，PBS洗滌，最后加入1×PBS 200μL于高內(nèi)涵成像儀讀數(shù)并拍照，注意避光操作。免疫熒光分析細(xì)胞內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、CHOP、ATF4、P-eIF2α表達(dá)的變化。

2 結(jié)果

2.1匹諾塞林對細(xì)胞活力及LDH的影響 與對照組比較，OGD/R組細(xì)胞活力明顯下降、LDH釋放明顯增加(P<0.05)；與OGD/R組比較：匹諾塞林各劑量組隨劑量增加細(xì)胞活力有逐步升高的趨勢(P<0.05)；匹諾塞林各劑量組LDH釋放減少，并隨劑量的增高呈遞降趨勢(P<0.05)。見表1。

2.2匹諾塞林對細(xì)胞凋亡的影響 凋亡形態(tài)：對照組細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻藍(lán)色熒光，細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)均勻分布，極少數(shù)呈現(xiàn)固縮濃染的核；OGD/R組出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核變小并發(fā)生濃縮，碎裂成三角形、圓形或多邊形團塊；匹諾塞林0.01、0.1、1μM各劑量組能明顯改善上述凋亡相關(guān)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(見封三圖1)。凋亡率：與對照組比較，OGR/D組明顯升高(P<0.05)；與OGD/R比較，匹諾塞林能減少細(xì)胞凋亡，并隨劑量的增高呈遞降趨勢(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞活力、LDH及凋亡率的比較

2.3匹諾塞林對ERS途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 GRP78：與對照組比較，OGD/R組GRP78表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與OGD/R組比較，匹諾塞林能增高GRP78的表達(dá)，且隨劑量增加有逐步升高的趨勢(P<0.05)；CHOP、P-eIF2α及ATF4：與對照組比較，OGD/R組三者表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；與OGD/R組比較，匹諾塞林能降低三者表達(dá)，且隨劑量的增高呈遞降趨勢(P<0.05)。見表2，封三圖2-5。

表2 各組ERS凋亡蛋白表達(dá)的比較熒光值)

3 討論

腦組織缺血后首先引起腦細(xì)胞氧及葡萄糖的耗竭，體外OGD/R模型可較好地模擬體內(nèi)腦缺血再灌注對細(xì)胞造成的損傷[6]。SH-SY5Y細(xì)胞株來源于人類胚胎中腦組織，其細(xì)胞形態(tài)、生理生化功能與正常神經(jīng)元相似，可選取SH-SY5Y細(xì)胞制作OGD/R模型。匹諾塞林可減輕缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧SH-SY5Y損傷，減少細(xì)胞凋亡，在體外進(jìn)一步確證了其減輕腦缺血再灌注損傷的作用。

ERS是指內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)遭受缺血缺氧等有害因素的破壞，出現(xiàn)錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài)。ERS發(fā)生時細(xì)胞自身可通過減少蛋白質(zhì)的合成，或增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊功能及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，提高細(xì)胞在有害因素下的生存能力[7]。但是，當(dāng)ERS非常劇烈或者持久時，細(xì)胞損傷過于嚴(yán)重，ERS不能使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及時恢復(fù)到正常，最終凋亡機制就會被觸發(fā)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8-9]。有研究認(rèn)為，腦缺血再灌注能引發(fā)ERS，造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展[5]。

GRP78是ERS的經(jīng)典標(biāo)志物，參與蛋白質(zhì)折疊修飾，并可以作為鈣結(jié)合蛋白維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡。ERS發(fā)生時，GRP78大量表達(dá)并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，恢復(fù)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本實驗中，SH-SY5Y細(xì)胞在缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷后，GRP78表達(dá)上調(diào)，說明缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧可引發(fā)ERS，而匹諾塞林能進(jìn)一步增加GRP78的表達(dá)，這可能是其對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮細(xì)胞保護作用的機制之一。

CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下細(xì)胞內(nèi)表達(dá)非常低。當(dāng)ERS發(fā)生時，其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)明顯增加，是ERS引起細(xì)胞凋亡的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[10]。關(guān)于CHOP凋亡通路，尚未完全清楚，考慮與抑制Bcl-2表達(dá)、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激有關(guān)。因此，CHOP表達(dá)可能與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[11]。本實驗證實，缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧SH-SY5Y細(xì)胞CHOP表達(dá)增加，匹諾塞林能降低其表達(dá)，這也可能是其減少細(xì)胞凋亡的原因。

ERS發(fā)生時，PERK-eIF2α-ATF4是CHOP蛋白表達(dá)增高最主要的通路[12]。PERK發(fā)生自身磷酸化被激活，然后特異性磷酸化eIF2α，降低新生蛋白的翻譯速率，保護內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能。但同時還會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ATF4上調(diào)。ATF4進(jìn)入胞核后激活CHOP的表達(dá)。本實驗結(jié)果表明，在缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧SH-SY5Y細(xì)胞模型中，P-eIF2α和ATF4表達(dá)均升高，匹諾塞林能降低二者的表達(dá)，這個趨勢與CHOP的表達(dá)趨勢一致。推測匹諾塞林下調(diào)CHOP的表達(dá)可能是通過調(diào)控其上游PERK-eIF2a-ATF4通路實現(xiàn)的。

綜上所述，缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧能使SH-SYHY細(xì)胞發(fā)生ERS，使CHOP表達(dá)增加，造成細(xì)胞損傷引發(fā)凋亡。匹諾塞林在ERS發(fā)生時，一定條件下能提升GRP78的表達(dá)，穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，發(fā)揮細(xì)胞保護作用，同時通過調(diào)控PERK-eIF2a-ATF4通路，降低CHOP表達(dá)，減少缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧SH-SYHY細(xì)胞的凋亡。該研究結(jié)果可為深入探討匹諾塞林治療腦缺血再灌注提供新的啟示。