張畢明，張 利，侯正利，譚德勇，孫 菁

（1.長沙市第四醫(yī)院，長沙 410006；2.圣湘生物科技有限公司，長沙 410006）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella），革蘭染色陰性、可發(fā)酵乳糖、無動力的需氧桿狀細(xì)菌，是一種機(jī)會性感染病原體可引起社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染，可導(dǎo)致尿路感染、肺炎、外科傷口感染甚至敗血癥等［1-4］。碳青霉烯類抗生素是一類廣譜的β-內(nèi)酰胺類抗生素，常用于治療各類肺炎克雷伯菌感染的疾病。但據(jù)2016 年中國CHINET 耐藥數(shù)據(jù)監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥已超10%［5］。產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因，目前陸續(xù)鑒定出了多種耐藥基團(tuán)如KPC、CMY-2、CTX-M、SHV 等，耐藥率高，多耐藥和泛耐藥肺炎克雷伯菌株給臨床診療用藥提出了巨大的挑戰(zhàn)。

目前，培養(yǎng)仍舊是分離鑒定肺炎克雷伯菌株的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床樣本培養(yǎng)時(shí)間長，不能滿足快速診斷的要求?；|(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)［6］、全基因組測序技術(shù)［7］、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［8］等檢測技術(shù)不斷革新肺炎克雷伯菌株的耐藥基因診斷，但受限于引物和探針設(shè)計(jì)、檢測成本、報(bào)告周期長等諸多因素，大部分尚未實(shí)現(xiàn)臨床落地開展檢測［9］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法比較，具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、大批量檢測、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，可滿足臨床快速檢測需求。

本研究通過設(shè)計(jì)特異性探針和引物，優(yōu)化檢測體系條件、反應(yīng)體組分用量、靈敏性和特異性驗(yàn)證等，建立了肺炎克雷伯菌和耐藥基因KPC/CMY-2 熒光定量PCR 檢測體系，下一步將建立更多的多重基因檢測體系，可為臨床提供快速檢測碳青霉烯類、三代頭孢菌素等抗菌素耐藥性耐藥基因分子檢測平臺，并可直接檢測臨床疑似肺炎克雷伯菌感染患者痰液標(biāo)本，為臨床應(yīng)用奠定理論和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 肺炎克雷伯菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 700603）；肺炎克雷伯菌核酸抽提使用賽默飛世爾公司的樣本釋放劑或核酸純化試劑按照說明書操作；熒光定量PCR 儀為宏石SALN-96P、ABI7500。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)G e n e b a n k 中肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株設(shè)計(jì)引物為T 3-F ：5’-C A G C T G C C G T T G C G A A C G-3’、 T 3-R ：5’-CGGCACAGAGTTCGCCGA-3’。預(yù)期片段大小為589bp，引物為賽默飛世爾公司合成。同時(shí)為肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類基因KPC、CMY-2 分別為：T3-F：5’- AGCCTTGACCCGCGCAAG-3’、T3-R：5’-AGCGTGACGACCATGCCG-3’；T3-F：5’- AAATCGTT ATGCTGCGCTCTGCTG-3’、T3-R：5’- TATCGGCTTTA CCCCAGGTGAAA-3’。

1.3 肺炎克雷伯菌熒光定量PCR 方法的建立 檢測體系設(shè)置目標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)引物探針，其中FAM 熒光基團(tuán)標(biāo)記肺炎克雷伯菌探針；人管家基因Rnase P 為內(nèi)標(biāo)基因，CY5 熒光基團(tuán)標(biāo)記。反應(yīng)總體系為50μL，其中引物、探針、Taq 酶、dNTPs、MgCl2、PCR buffer 共45μL，模板DNA 5μL，使用宏石SLAN-96P 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以生理鹽水作為空白對照，對引物濃度（2.5、5、10、15 pmol/L）、探針用量（1.25、2.5、5、7.5 pmol）、Taq 酶（5、10、15、20U）、dNTPs（0.5、1.0、1.5、2.0μL/人份）、MgCl2濃度（0.1、0.2、0.3、0.4μL），擴(kuò)增反應(yīng)預(yù)變性時(shí)間（95℃ 1 min、95℃5 min）、退火延伸溫度和時(shí)間（55、60、65℃；10 、20 、30 s）、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（41、45、50）分別進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 肺炎克雷伯菌耐藥基因KPC/CMY-2 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測體系的建立 肺炎克雷伯菌耐藥基因KPC/CMY-2 檢測反應(yīng)體系為50μL，其中模板DNA10μL。以生理鹽水為空白對照，對反應(yīng)體系中所用引物濃度（2.5、5、7.5、10 pmol/人份）、探針用量（1.5、2.5、3.5、5 pmol/人份）、Taq 酶（6、9、12、15U/人份）、dNTPs（0.5、1.0、1.5、2μL/人份）、MgCl2濃度（0.01、0.03、0.05、0.07 mol/L）等進(jìn)行篩選優(yōu)化，同時(shí)對擴(kuò)增反應(yīng)過程中的預(yù)變性時(shí)間（94℃，5 min；94℃，2 min），退火和延伸溫度（55℃、57℃、60℃）、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（40、45、50）等反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)節(jié)與優(yōu)化。

1.5 肺炎克雷伯菌核酸耐藥基因KPC/CMY-2 核酸檢測體系性能優(yōu)化驗(yàn)證 設(shè)定6 個(gè)（1E3、5E2、1E2、5E1、1E1、5E0）（copies/μL）參考品濃度梯度，各重復(fù)檢測20次，采用probit 算法確定最低檢測限；并在宏石SLAN-96P 和ABI7500 以最低檢測限為參考品，分別重復(fù)檢測20 次，進(jìn)行最低檢測限驗(yàn)證。隨后，選取陰性樣本、低濃度質(zhì)控品2E1、中濃度質(zhì)控品1E2，每個(gè)樣本重復(fù)測定20 次，統(tǒng)計(jì)陰性樣本、1E2、2E1 的檢出率，分別統(tǒng)計(jì)檢測Ct 值的變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）評估本試劑盒批內(nèi)和批間精密度，和日內(nèi)、日間精密度的CV。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法的建立與條件優(yōu)化 綜合反應(yīng)時(shí)間、擴(kuò)增產(chǎn)物特異性與產(chǎn)物量等因素，確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性時(shí)間95℃ 1 min，95℃變性10 s，退火、延伸溫度及熒光信號采集為60℃、20 s，共擴(kuò)增45 個(gè)循環(huán)數(shù)，總反應(yīng)時(shí)間90 min。反應(yīng)體系中引物濃度10 pmol/人份、探針5pmol/人份、Taq 酶15U/人份、dNTPs1.0μL，MgCl2用量為0.2μL/人份。優(yōu)化后進(jìn)行小試生產(chǎn)檢測，以生理鹽水為空白對照和肺炎克雷伯菌陰性樣本為陰性對照，肺炎克雷伯菌DNA 的樣本呈良好的擴(kuò)增曲線，且肺炎克雷伯菌和內(nèi)標(biāo)基因Ct 值均≤35（圖1）。

圖1 肺炎克雷伯菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性擴(kuò)增曲線

2.2 肺炎克雷伯菌耐藥基因KPC/CMY-2 檢測體系設(shè)計(jì) 通過對反應(yīng)組分和條件摸索，確定引物濃度5 pmol/人份、探針2.5 pmol/人份、Taq 酶9U/人份、dNTPs 1.0μL/人份、MgCl20.03 mol/L 時(shí)，肺炎克雷伯菌兩個(gè)耐藥基因KPC 和CMY-2 呈良好的擴(kuò)增曲線（圖2），反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 15 s；57℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)退火階段收集熒光信號，總反應(yīng)時(shí)間90 min。

圖2 肺炎克雷伯菌耐藥基因KPC/CMY-2熒光定量PCR擴(kuò)增曲線（A：宏石SLAN-96P擴(kuò)增曲線；B：ABI7500擴(kuò)增曲線）

2.3 肺炎克雷伯菌耐藥基因KPC/CMY-2 檢測體系性能優(yōu)化驗(yàn)證 Probit 算法確定本檢測體系最低檢測下限為13.57 copies/μL，綜合后定為15 copies/μL（圖3A、B）。隨即在宏石SALN-96P、ABI7500 擴(kuò)增儀進(jìn)行最低檢測限驗(yàn)證，以1.5E1 為參考濃度，重復(fù)測定20 次后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示檢出率為100%，符合檢測率≥95%表示靈敏度驗(yàn)證通過（圖3C、D、E）。

圖3 肺炎克雷伯菌耐藥基因KPC/CMY-2檢測體系靈敏度驗(yàn)證（A：不同濃度梯度檢測耐藥基因KPC/CMY-2在宏石SLAN-96P擴(kuò)增曲線；B：Probit算法確定檢測體系檢測能力；C：1.5E1參考品濃度在宏石、ABI7500擴(kuò)增儀擴(kuò)增曲線，n=20；D、E：耐藥基因KPC、CMY和內(nèi)標(biāo)基因IC分別在7500和宏石擴(kuò)增儀的Ct值統(tǒng)計(jì)）

如圖4 所示，陰性樣本（negative control；NTC）在兩個(gè)不同批號試劑檢測的陽性檢出率均為0%；低濃度質(zhì)控品2E1 的陽性檢出率均為100%。兩個(gè)批號試劑盒批內(nèi)精密度Ct 的CV 范圍為：0.30%-1.28%；批間精密度Ct 的CV 范圍為：0.54%-1.50%。因此，可以認(rèn)為本試劑盒批內(nèi)、批間均有著很好的檢測精密度。

圖4 肺炎克雷伯菌耐藥基因KPC-CMY-2檢測體系批內(nèi)、批間精密度驗(yàn)證

兩批試劑盒檢測體系日內(nèi)精密度Ct 的CV 范圍為：0.44%～2.52%；兩批試劑盒檢測體系日間精密度Ct 的CV 范圍為：0.77%～4.36%，均小于5%。結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了本檢測體系在不同的操作者下和不同的時(shí)間內(nèi)檢測均有著較好的檢測靈敏度和精密度。

3 討論

肺炎克雷伯菌（Klebsiella），是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原體，約占革蘭陰性菌感染的1/3，可導(dǎo)致肺炎、尿路感染、手術(shù)傷口感染甚至菌血癥等，主要易感因素為免疫功能受損和侵入性操作［10］。高毒力型肺炎克雷伯菌可引起無基礎(chǔ)疾病社區(qū)健康人群觸發(fā)侵襲性感染，以化膿性肝膿腫最為常見，還可包括眼內(nèi)炎、腦膜炎、骨髓炎和壞死性筋膜炎等［11，12］。碳青霉烯類抗生素歷來是治療肺炎克雷伯菌感染的首選藥物，但由于近年臨床對碳青霉烯類抗生素濫用導(dǎo)致選擇壓力，造成肺炎克雷伯菌多耐藥、泛耐藥等耐藥基因的突變和播散。多種碳青霉烯酶相繼發(fā)現(xiàn)，其中KPC 酶是最重要的碳青霉烯酶，可由質(zhì)粒介導(dǎo)快速傳播［13］，同時(shí)在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中還可普遍觀察到其他重要的β-內(nèi)酰胺酶如SHV、CTX-M、TEM 等，可水解早期頭孢菌素和青霉素［14］。因其抗生素的選擇壓力及耐藥基因突變率高，愈加擴(kuò)大抗生素的耐藥范圍，使得臨床早期正確用藥壁壘重重。

目前，細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定仍是常用的肺炎克雷伯菌的檢測方法，但其操作流程繁瑣且耗時(shí)耗力，不能滿足臨床快速診斷的訴求。肺炎克雷伯菌耐藥性復(fù)雜多變，傳統(tǒng)的體外藥物敏感試驗(yàn)，操作時(shí)間長，敏感性、特異性受限，目前最新質(zhì)譜技術(shù)也不能成熟檢測細(xì)菌耐藥基因［15］。分子生物學(xué)檢測方法因其靈敏、快速的特質(zhì)可極大地彌補(bǔ)培養(yǎng)周期長的缺陷，在最佳治療時(shí)間指導(dǎo)臨床抗生素用藥。本研究針對肺炎克雷伯菌和耐藥基因KPC-CMY-2 設(shè)計(jì)引物和探針，建立熒光定量PCR反應(yīng)檢測體系，能滿足臨床快速診斷肺炎克雷伯菌，檢測時(shí)間為90 min，可呈批量檢測。兩套檢測體系可根據(jù)擴(kuò)增曲線實(shí)時(shí)、直觀的觀察檢測全過程，無需進(jìn)行PCR產(chǎn)物凝膠電泳就可報(bào)告臨床檢測結(jié)果。本研究檢測體系特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測下限可低至13.57 copies/μL，且檢測試劑盒批內(nèi)、批間和日內(nèi)、日間精密度CV均小于5%。后續(xù)我們進(jìn)一步收集臨床菌株，對肺炎克雷伯菌和耐藥基因KPC/CMY-2 進(jìn)行臨床菌株檢測驗(yàn)證，表達(dá)量分析與臨床診療、抗生素用藥關(guān)聯(lián)等方面進(jìn)行臨床落地應(yīng)用實(shí)踐。肺炎克雷伯菌和耐藥基因KPCCMY-2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測體系的建立，可建立快速檢測肺炎克雷伯菌，和耐碳青霉烯類、三代頭孢菌素等抗菌素耐藥性基因分子檢測平臺。多重PCR 檢測體系可為本地區(qū)肺炎克雷伯多重耐藥基因的流行病學(xué)調(diào)查、感染治療提供實(shí)驗(yàn)室理論和實(shí)踐數(shù)據(jù)指導(dǎo)。