呂針黎， 魏 來,2， 譚思由，李 蓓，楊 浩，孔高茵,2

(1.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410005；2.湖南省圍術(shù)期加速康復(fù)麻醉臨床醫(yī)學(xué)研究中心，長(zhǎng)沙 410005)

肝葉切除和肝移植等肝臟外科手術(shù)常采取阻斷入肝血流等方式控制出血，而由此操作造成的肝臟血流暫時(shí)性阻斷及隨后的血流再灌注通常引起肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion, HIRI)[1-2]。肝門阻斷后門脈回流受阻可導(dǎo)致腸道循環(huán)淤血和代謝產(chǎn)物蓄積,阻斷解除時(shí)肝臟內(nèi)的毒性物質(zhì)可經(jīng)血液流至腸道導(dǎo)致腸道雙重?fù)p害，導(dǎo)致腸道屏障功能受損、腸道菌群失調(diào)、細(xì)菌和內(nèi)毒素移位到體循環(huán)誘發(fā)菌血癥[3]。HIRI 引發(fā)的腸道損傷等一些列反應(yīng)可誘導(dǎo)大量相關(guān)炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子產(chǎn)生釋放，促使機(jī)體發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征。因此,腸道也被稱為多器官功能衰竭(Multiple-organ-failure syndrome,MOFS)的“motor”[4]。有研究表明，缺血再灌注損傷導(dǎo)致的多種術(shù)后并發(fā)癥，如感染，會(huì)顯著增加術(shù)后死亡率[5-6]，而肝移植術(shù)后早期并發(fā)癥以感染為主, 且在術(shù)后早期死亡的病例中，感染約占64%[7]，這可能與肝臟血流阻斷再灌注導(dǎo)致腸粘膜損害引起的細(xì)菌/內(nèi)毒素移位有關(guān)[8]。現(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)電針預(yù)處理對(duì)腦、心臟等重要臟器的缺血再灌注具有保護(hù)作用[9-10]。同時(shí)，亦有研究證明針刺“天樞”“足三里”等穴位具有調(diào)節(jié)腸道菌群組成的作用[11-12]。而現(xiàn)有研究中，缺乏探究此二穴對(duì)HIRI 所致的腸道損傷作用的相關(guān)研究。故而本研究擬通過電針預(yù)處理“天樞”及“足三里”穴，觀察其對(duì)HIRI 大鼠腸道菌群組成及內(nèi)毒素變化的影響，旨在豐富穴位刺激改善HIRI 相關(guān)腸道功能損害的理論機(jī)制、為臨床實(shí)踐提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量200±20g(購(gòu)買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK(湘)2015-0013，)，飼養(yǎng)于湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物房?jī)?nèi)，正常進(jìn)食飲水，適應(yīng)性生存7d。按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、天樞-足三里穴組及非經(jīng)非穴組，每組各8 只。術(shù)前禁食6～8 h，不禁飲。

1.2 主要儀器和試劑 儀器及設(shè)備：SDZ-Ⅱ型華佗牌電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，不銹鋼毫針(華佗牌，蘇州醫(yī)療用品有限公司)，AnymicroDSSTM 圖像采集系統(tǒng)，德國(guó)LEICARM2245 型石蠟切片機(jī)，2.5L厭氧產(chǎn)氣包(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)；試劑：蘇木素-伊紅(HE)染色液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，ALT、AST、D-乳酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)生物)，大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)；藥品：麻醉劑采用濃度為10%的水合氯醛溶液(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 HIRI 模型制備及取材方法 對(duì)于模型組、天樞-足三里組及非經(jīng)非穴組大鼠，采用10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定大鼠、備皮、消毒，于劍突下沿正中線做一約3cm 長(zhǎng)切口，參照Filos 等[14]方法建模，即暴露第一肝門，并使用無創(chuàng)血管夾夾閉阻斷入肝血流30min；隨后松開血管夾，腹腔滴入0.5ml 生理鹽水后縫合腹部切口；4h 后肝臟再灌注完成。模型構(gòu)建成功后，可觀察到肝臟組織呈花斑和蒼白條索樣紋路改變，腸壁呈深紫色并出現(xiàn)廣泛水腫。隨即經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3～5mL 于采血管中，4℃直立靜置30min 后于4℃、3000 r/min 離心20 min，取上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；迅速切取末端回腸6cm 于10%中性福爾馬林溶液中固定；無菌操作下取腸內(nèi)容物0.1g，置于裝有玻璃珠的無菌搖菌管中，加入0.9mL 0.9%生理鹽水，200r/min 震蕩10min，使腸內(nèi)容物均質(zhì)化，此即為第一稀釋度10-1，備用。假手術(shù)組僅行剖腹、第一肝門暴露30min 后縫合，4h 后取材。

1.4 電針干預(yù)方法 天樞-足三里穴在建模前按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，取大鼠雙側(cè)“天樞”穴及“足三里”穴，消毒后使用0.33 mm× 13mm 的無菌針灸針直刺入相應(yīng)穴位，左右各一針，針刺深度約為3mm，其中同側(cè)“天樞”和“足三里”分別連接電針儀的正負(fù)極，并采用疏密波，頻率2/100Hz，強(qiáng)度以能見到大鼠肌肉輕微顫動(dòng)為宜，干預(yù)時(shí)間為30min。

非經(jīng)非穴組在“天樞”及“足三里”外側(cè)旁開5mm的非經(jīng)非穴區(qū)，分別用針灸針直刺約3mm，其中同側(cè)兩針分別連接電針儀正負(fù)極。干預(yù)參數(shù)及干預(yù)時(shí)間同天樞-足三里組。

1.5 培養(yǎng)基配制方法 分別嚴(yán)格按照培養(yǎng)基配制說明書配制EMB 大腸桿菌培養(yǎng)基、Pfizer 腸球菌培養(yǎng)基、MRS 乳酸桿菌培養(yǎng)基以及莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良MRS 雙歧桿菌培養(yǎng)基。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 血清學(xué)方法測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT) 和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平 取各組干預(yù)結(jié)束后已離心的大鼠血清，嚴(yán)格按ALT 及AST 檢測(cè)試劑盒說明書步驟操作。

1.6.2 形態(tài)學(xué)觀察 取各組于10%中性福爾馬林溶液中固定的腸道組織，HE 染色后光鏡下觀察各組腸道組織病理形態(tài)，以Chiu’s 法評(píng)價(jià)腸黏膜損傷程度：0 分，正常絨毛；1 分，絨毛頂端下間隙增寬；2 分，絨毛頂端上皮脫落、破潰；3 分，絨毛頂端破壞擴(kuò)展到基底部；4 分，上皮完全脫落；5 分，固有層崩潰，出現(xiàn)潰瘍及出血點(diǎn)。

1.6.3 ELISA 法測(cè)定血清D-乳酸(D-lactate,DLac)、內(nèi)毒素(endotoxin,ET)水平 嚴(yán)格按照D-乳酸及內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒說明書步驟操作。

1.6.4 細(xì)菌培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù) 取10-1腸內(nèi)容物稀釋液進(jìn)行10 倍倍比稀釋，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)后，分別取稀釋度為10-5、10-6、10-6、10-4標(biāo)本200uL，分別滴加于EMB 大腸桿菌培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基、MRS 乳酸桿菌培養(yǎng)基、 改良MRS 雙歧桿菌培養(yǎng)基上,每一組標(biāo)本分別滴加至兩個(gè)培養(yǎng)基。然后用無菌“L”型棒分角度旋轉(zhuǎn)涂抹平板，使菌液均勻的涂布在整個(gè)平皿表面。大腸桿菌(EMB)和腸球菌(EC)屬置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 小時(shí)；雙歧桿菌(BS)和乳桿菌屬(LBS)置于厭氧袋中，37℃培養(yǎng)48小時(shí)?；罹?jì)數(shù)：計(jì)數(shù)結(jié)果以log 菌落形成單位/g(CFU/g) 表示。公式：CFU/g=每一稀釋度菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/滴種體積(mL)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下各組大鼠腸道組織病理改變及病理損傷評(píng)分 假手術(shù)組示大致正常絨毛；模型組腸粘膜損傷明顯，絨毛破損脫落嚴(yán)重，可見上皮層與固有層分離，伴有毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；天樞-足三里組可見上皮下間隙擴(kuò)張，可見毛細(xì)血管充血，偶見絨毛破損；非經(jīng)非穴組可見上皮下間隙增大、毛細(xì)血管充血，絨毛破損。見圖1。Chiu’s 法評(píng)分結(jié)果顯示：模型組高于假手術(shù)組(P<0.01)， 天樞-足三里組低于模型組及非經(jīng)非穴組(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠腸道組織Chiu’s法評(píng)分比較(分)

圖1 各組大鼠腸道組織光鏡下病理學(xué)改變(HE, ×100)

2.2 各組大鼠血清中ALT 和AST 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠ALT、AST 含量顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，天樞-足三里組ALT、AST 含量均降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清ALT和AST含量比較(卡門氏單位)

2.3 各組大鼠血清中D-乳酸及內(nèi)毒素水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠內(nèi)毒素、D-乳酸含量顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，天樞-足三里組內(nèi)毒素、D-乳酸含量均降低(P<0.01)；且天樞-足三里組內(nèi)毒素含量低于非經(jīng)非穴組(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠血清中D-乳酸及內(nèi)毒素水平比較

2.4 各組大鼠腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌菌落數(shù)量比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數(shù)量降低(P<0.01)，大腸桿菌菌落數(shù)量增加(P<0.01)；與模型組相比，天樞-足三里組大鼠腸道菌群中雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落數(shù)量增加(P<0.01)，大腸桿菌菌落數(shù)數(shù)量降低(P<0.01)，但腸球菌各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌菌落數(shù)比較(logCFU/g)

3 討論

有研究[13]指出，當(dāng)發(fā)生肝臟缺血再灌注時(shí)，術(shù)后肝功能衰竭似乎是肝切除術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，但造成術(shù)后肝功能衰竭的諸多因素也可能是造成腸道屏障損害的原因。而HIRI 造成腸粘膜損害進(jìn)而導(dǎo)致腸道屏障受損的原因又可包括門脈高壓、活性氧(ROS)的釋放、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡或者細(xì)胞壞死等[3]。已有報(bào)道證實(shí)HIRI 不僅對(duì)肝臟造成損傷，還會(huì)由于再灌注后的氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)引起其他遠(yuǎn)隔器官如肺、腎、腸道、胰腺、腎上腺和心臟等器官的損傷，從而造成MODS。Filos 團(tuán)隊(duì)[14]及 Lemaire 團(tuán)隊(duì)[15]分別通過對(duì)大鼠及豬進(jìn)行構(gòu)建肝臟缺血再灌注模型，觀察到細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位增加，以及腸道屏障的早期破壞。同時(shí)由于門脈阻斷導(dǎo)致腸道水腫，腫脹的腸壁又致腹內(nèi)壓過高進(jìn)而可能加劇腸道灌注的不足以及腸道屏障的損害[16-17]。且腸道蠕動(dòng)功能的下降也會(huì)導(dǎo)致腸道細(xì)菌的過負(fù)荷，這也會(huì)反過來對(duì)腸粘膜造成損害[18]。在本試驗(yàn)中，通過對(duì)大鼠進(jìn)行30min 的肝門阻斷，可明顯觀察到腸壁由淡粉色變?yōu)樯钭仙⒈憩F(xiàn)出廣泛水腫。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出模型組與假手術(shù)組相比，血清中內(nèi)毒素水平更高，并且菌群數(shù)量變化明顯。

在腸道微生物中，乳酸桿菌和雙歧桿菌在維持腸道粘膜的定植抗性以及保護(hù)腸道屏障方面發(fā)揮了重要的作用[19-20]。而任何引起腸道微生態(tài)紊亂的因素都可能使腸道優(yōu)勢(shì)繁殖的細(xì)菌如大腸桿菌、腸球菌等突破受損的腸道粘膜屏障而移位。Hui-Chun Xing[21]等通過對(duì)肝臟缺血再灌注大鼠的回腸內(nèi)容物進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)I/R 組乳酸桿菌及雙歧桿菌菌落數(shù)少于未經(jīng)過I/R 的空白組大鼠，腸桿菌菌落數(shù)多于空白組大鼠，同時(shí)I/R 組內(nèi)毒素水平也明顯高于空白組。同時(shí)通過添加外來益生菌乳酸桿菌及雙歧桿菌菌株，發(fā)現(xiàn)益生菌組大鼠的肝臟、腸道病理改變以及內(nèi)毒素水平均得到改善及降低。而D-乳酸是胃腸道固有細(xì)菌的產(chǎn)物,哺乳類動(dòng)物既不產(chǎn)生D 乳酸,也不能或僅能緩慢代謝D-乳酸,因此循環(huán)血中D-乳酸濃度的增加實(shí)際上反映了腸黏膜通透性增加。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)大鼠回腸內(nèi)容物進(jìn)行選擇性細(xì)菌培養(yǎng)和血清D-乳酸水平測(cè)定，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠回腸內(nèi)容物中乳酸桿菌及雙歧桿菌菌落數(shù)少于假手術(shù)組，腸桿菌菌落數(shù)高于假手術(shù)組，血清D-乳酸水平顯著高于假手術(shù)組，也說明HIRI 使腸道粘膜受損。

現(xiàn)代研究表明穴位刺激(Acupoint Stimulation,AS)通過對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)的調(diào)控，減輕組織氧化應(yīng)激損傷、降低炎癥因子的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[22]，從而對(duì)多個(gè)器官和系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)作用。而電針(Electric Acupuncture，EA)作為AS 的常用方法之一,在刺激強(qiáng)度、刺激頻率等方面更具量化與標(biāo)準(zhǔn)化，從而被更加廣泛的應(yīng)用于臨床。既往研究中[23-24]，通過對(duì)不同模型大鼠進(jìn)行天樞穴(ST25)、足三里穴(ST36)等穴位的不同AS，發(fā)現(xiàn)其腸道菌群的組成得到改善。在本實(shí)驗(yàn)中，通過EA 天樞(ST25)及足三里穴(ST36)后與模型組相比，發(fā)現(xiàn)天樞-足三里組大鼠腸道菌群中雙歧桿菌及乳酸桿菌菌落數(shù)增加，大腸桿菌菌落數(shù)下降，且內(nèi)毒素及代表腸道屏障功能的D-乳酸水平也有所下降。由此也可能說明電針刺激天樞及足三里穴可以保護(hù)腸道屏障功能以及改善內(nèi)毒素血癥。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)HIRI 大鼠進(jìn)行天樞(ST25)及足三里穴(ST36)的電針預(yù)處理，通過病理結(jié)果可以觀察到腸道粘膜狀況得到改善，血清內(nèi)毒素及D-乳酸水平下降，以及腸道雙歧桿菌菌落數(shù)、乳酸桿菌菌落數(shù)的增多與大腸桿菌菌落數(shù)的減少。表明電針預(yù)處理天樞(ST25)及足三里穴(ST36)可能會(huì)對(duì)HIRI 后的腸道屏障產(chǎn)生保護(hù)作用，使腸道菌群的組成以及內(nèi)毒素血癥得到改善。而在未來可以通過16S rRNA 高通量測(cè)序等方法對(duì)腸道微生物相對(duì)豐度、多樣性以及整體結(jié)構(gòu)與組成進(jìn)行更詳盡的分析，從而更好的指導(dǎo)臨床應(yīng)用。