謝 陽, 張 翼, 石海珠, 吳兆菊, 余雪弘, 張純姑, 封 順

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 四川 成都 610031)

諾氟沙星(NFX)是一種氟喹諾酮類抗生素,目前廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)。但研究發(fā)現(xiàn)其可能殘留于動物體內(nèi),進而對人體健康造成危害[1]。因此許多國家和組織對肉類食品中NFX的殘留進行了嚴(yán)格規(guī)定,如歐盟(EU)規(guī)定NFX最大殘留量(MRL)為0.1 mg/kg[2]。針對NFX,已經(jīng)發(fā)展出液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[3]、毛細(xì)管電泳免疫分析法[4]等眾多方法。但在測定之前,為消除肉類產(chǎn)品復(fù)雜基質(zhì)的影響,在測試前均需先對樣本進行前處理。

分子印跡聚合物(MIPs)是一種具有選擇性的功能高分子材料。它以目標(biāo)化合物為模板分子,模擬“抗原-抗體”間的分子識別作用,對模板分子表現(xiàn)出選擇性識別能力[5]。近年來因其具有親和性好、選擇性高、抗干擾性強、使用壽命長等優(yōu)點[6],已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物[7]、食品[3]、生物[8]和環(huán)境樣品[5]中目標(biāo)分子的特異性識別。共價有機框架(COFs)是一類具有均勻有序晶體結(jié)構(gòu)的新型有機聚合物,由輕元素(H、B、C、N和O)組成[9],是通過可逆的化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建有機單元進行有序組裝而形成的晶體材料[10]?；谄涮厥饨Y(jié)構(gòu),COFs在氣體儲存[11]、多相催化[12]、光電[13,14]、傳感[15]和藥物傳遞[16]等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景,特別是形貌規(guī)整、表面具有多個官能團、易于修飾的特性,使COFs表現(xiàn)出作為MIPs載體的巨大潛力[17,18]。

基于COFs的顯著優(yōu)點,科研人員也將COFs作為載體應(yīng)用于MIPs的制備[19,20]。其中,劉慧琳等制備了一系列針對色胺[21]、2,4,6-三硝基苯酚[22]、4-乙基愈創(chuàng)木酚[23]等的共價有機框架分子印跡聚合物復(fù)合材料(COF@MIPs)。上述COF@MIPs對目標(biāo)分子表現(xiàn)出高特異性和高選擇性,但制備過程繁瑣耗時,僅COFs的合成就需在120 ℃下反應(yīng)3天。在2017年,Matsumoto等[24]提出了一種在20 ℃下,以金屬三氟酸鹽為催化劑快速制備亞胺鍵連接的COFs。受此啟發(fā),本文針對NFX,發(fā)展了一種快速、簡便制備DP-COF@MIPs的新方法,并將其成功應(yīng)用于牛奶中微量NFX的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM, ProX,荷蘭Phenom Word公司), X射線衍射儀(XRD, PW 3040/60,荷蘭PANalytical B. V.公司),傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR, Nicolet 6700,美國Thermo Fisher公司), BET比表面積分析儀(ASAP 2020,美國Micromeritics公司),紫外-可見光譜儀(UV-Vis, UV-1800 PC,中國AOE設(shè)備有限公司),納米粒度電位分析儀(ZEN 3600,英國Malvern公司)。HPLC儀包括LC-2030 Plus型(日本島津公司,UV-Vis檢測器,用于競爭性吸附實驗)和Waters 1525型(美國 Waters公司,2998 PDA檢測器,用于實際樣本的測定)。

諾氟沙星(NFX)、環(huán)丙沙星(CPFX)、二甲硝咪唑(DMZ)、土霉素(OTC)、磺胺嘧啶(SDZ)和氯霉素(CAP)來自安耐吉化學(xué)品有限公司。二氧六環(huán)、3,3′-二氨基聯(lián)苯胺、對苯二甲醛、1,3,5-三甲苯、三氟甲基磺酸鈧(Ⅲ)、對苯二酚、二甲基亞砜(DMSO, AR, ≥99.0%)和氫氧化鈉(NaOH)均來自上海阿拉丁有限公司。甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和偶氮二異丁腈(AIBN)購自上海Adamas有限公司。甲醇、乙醇和丙酮從成都科隆化學(xué)試劑廠購得。以上試劑均為分析純。實驗全過程使用超純水(18.2 MΩ·cm)。

牛奶樣品購自四川成都市超市。

1.2 共價有機框架的制備

如圖1所示,將43 mg 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺和54 mg對苯二甲醛分別分散在1.7 mL 1,3,5-三甲苯和0.3 mL二氧六環(huán)中,超聲30 min將混合物均勻分散。隨后加入3.2 mg三氟甲基磺酸鈧,在氬氣保護下室溫放置30 min,用甲醇多次洗滌后,60 ℃真空干燥,產(chǎn)物記為DP-COF。

圖 1 共價有機框架分子印跡聚合物(DP-COF@MIPs)的制備Fig. 1 Synthesis procedure of molecularly imprinted polymers based on 3,3′-diaminobenzidine and p-phthalaldehyde-covalent organic frameworks (DP-COF@MIPs)MAA: methacrylic acid; EGDMA: ethylene glycol dimethacrylate; NFX: norfloxacin.

1.3 共價有機框架分子印跡聚合物的制備

取10 mg DP-COF和0.35 mL MAA分散于3 mL DMSO中。向體系中加入4.4 mg對苯二酚,在120 ℃油浴下磁力攪拌45 min,自然冷卻至室溫;用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)至中性。加入EGDMA 2 mL, NFX 178 mg, AIBN 10 mg,丙酮5 mL,于70 ℃、磁力攪拌下反應(yīng)3 h。產(chǎn)物經(jīng)乙酸-甲醇溶液(1∶9, v/v)洗脫,以去掉結(jié)合的模板分子NFX。真空干燥后,得到共價有機框架分子印跡聚合物(DP-COF@MIPs)。

在相同的條件下(除不添加NFX)平行制備了非印跡共價有機框架聚合物(NIPs)。

1.4 吸附實驗

等溫吸附實驗 將3 mg DP-COF@MIPs或DP-COF@NIPs分散在3 mL 1～300 mg/L NFX標(biāo)準(zhǔn)溶液中,孵育90 min后,8 000 r/min離心3 min。使用UV-Vis分光光度計于277 nm處測定溶液中NFX的初始濃度和最終濃度。實驗重復(fù)3次(下同)。

動力學(xué)吸附實驗 將3 mg DP-COF@MIPs或DP-COF@NIPs分散于3 mL 10 mg/L NFX標(biāo)準(zhǔn)溶液中,按一定時間間隔(10～180 min),測定溶液上清液中NFX的濃度。

選擇性吸附實驗 將3 mg DP-COF@MIPs或DP-COF@NIPs分別懸浮于3 mL質(zhì)量濃度均為10 mg/L的CPFX、DMZ、OTC、SDZ、CAP的標(biāo)準(zhǔn)溶液中,孵育90 min后,UV-Vis測定吸附前后溶液中NFX(277 nm)、CPFX(275 nm)、DMZ(264 nm)、OTC(354 nm)、SDZ(254 nm)和CAP(319 nm)的濃度。

競爭性吸附實驗 將10 mg DP-COF@MIPs分散在3 mL NFX、CPFX、DMZ、OTC、SDZ和CAP的混合溶液中(各為10 mg/L),孵育90 min, 8 000 r/min離心3 min, 3 mL甲醇-水溶液(2∶1, v/v)洗滌2次。然后用3 mL乙酸-甲醇溶液(1∶9, v/v)洗脫。使用LC-2030 Plus HPLC儀對洗脫液進行分析[25]: YMC-Pack C8色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相為高純水(含0.2% NH3·H2O和0.4% H3PO4)-乙腈體系(85∶15, v/v);進樣量10 μL;流速1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長 277 nm。

1.5 重復(fù)使用性實驗

將3 mg DP-COF@MIPs分散于3 mL 10 mg/L NFX溶液中。孵育90 min后,離心,分離出上清液。在277 nm處用UV-Vis測定溶液中NFX濃度。隨后,將該DP-COF@MIPs用10 mL乙酸-甲醇溶液(1∶9, v/v)洗脫3次。然后再將DP-COF@MIPs重新放入10 mg/L的NFX溶液中,循環(huán)重復(fù)7次。

1.6 實際樣本的測定實驗

牛奶樣品參照Guan等[18]的工作進行處理:取1 mL牛奶放入離心管中,加入3 mL乙腈和標(biāo)準(zhǔn)的NFX溶液,使NFX最終質(zhì)量濃度為0、0.03、0.10或0.30 mg/L的加標(biāo)樣品。旋渦5 min后,于5 ℃以8 000 r/min離心5 min。然后向3 mL樣品中加入8 mg DP-COF@MIPs,按1.4節(jié)中競爭性吸附實驗步驟對樣本進行處理,但HPLC系統(tǒng)采用Waters 1525 HPLC, Waters Symmetry?C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)。除上述樣本之外,還配制了一個NFX含量低至0.002 0 mg/L的牛奶樣本。處理過程除樣本量和洗脫液為20 mL和2 mL外,其余步驟均相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 共價有機框架分子印跡聚合物的制備及表征

如圖1所示,本實驗所發(fā)展的方法與反向微乳液聚合[26]和一鍋合成[21]的方法相比,條件溫和,操作簡單,整個合成可在5 h內(nèi)完成。

圖2a XRD譜中,15.0°和27.8°處的密集衍射峰分別對應(yīng)于(010)和(100)面,該數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道[27]相符,證實了DP-COF成功制備。納米粒度電位分析儀測定結(jié)果(圖2b)表明DP-COF和DP-COF@MIPs的平均粒徑分別為311.6 nm和607.0 nm。由圖2c中可以明顯觀察到3,3′-二氨基聯(lián)苯胺和對苯二甲醛分子的IR特征吸收峰(3390 cm-1和1695 cm-1，分別歸于-NH2和-C=O)；合成DP-COF后，在1610 cm-1處出現(xiàn)了新峰(-C=N伸縮振動)，同時-C=O峰減弱；進一步包裹上MIPs層，F(xiàn)T-IR譜圖變得更為復(fù)雜，同時1695 cm-1峰顯著增強，這歸因于MAA和EGDMA分子上含有的大量-C=O官能團。這證實了DP-COF和DP-COF@MIPs的成功制備。而從圖3內(nèi)插圖中可以明顯觀察到DP-COF和DP-COF@MIPs及DP-COF@NIPs均為粉末,但DP-COF與DP-COF@MIPs和DP-COF@NIPs在顏色上存在明顯差異,這是由于DP-COF表面包覆上聚合物層所導(dǎo)致的。SEM照片證實DP-COF為球形(見圖3a),包覆上聚合物層后,表面變得更為粗糙(見圖3b和3c)；而與DP-COF@NIPs相比,DP-COF@MIPs擁有更大的孔隙。BET結(jié)果表明DP-COF@MIPs的比表面積為23.87 m2/g,平均孔徑為17.80 nm(見圖4a)。

圖 2 (a)共價有機框架(DP-COF)的X射線衍射圖譜,(b)DP-COF、DP-COF@MIPs的粒徑分布圖,以及(c)3,3′-二氨基聯(lián)苯胺、對苯二甲醛、DP-COF和DP-COF@MIPs的FT-IR光譜Fig. 2 (a) XRD pattern of DP-COF, (b) particle size distribution profiles of DP-COF and DP-COF@MIPs, and (c) FT-IR spectra of 3,3′-diaminobenzidine, p-phthalaldehyde, DP-COF, and DP-COF@MIPs Z-average: Z-average particle size; PdI: polydispersity index.

圖 4 DP-COF@MIPs和DP-COF@NIPs的吸附性能評價Fig. 4 Evaluation of adsorption characteristics of DP-COF@MIPs and DP-COF@NIPsb, e: n=3.

2.2 DP-COF@MIPs吸附行為研究

通過動力學(xué)吸附、等溫吸附、選擇性吸附和競爭性吸附實驗考察了DP-COF@MIPs的吸附性能和選擇性識別能力。吸附量通過公式(1)計算:

(1)

其中Q(mg/g)表示吸附量,C0(mg/L)為NFX的初始濃度,Ce(mg/L)為NFX在溶液中的平衡濃度,V(L)為溶液體積,m(g)為DP-COF@MIPs或DP-COF@NIPs的質(zhì)量。

動力學(xué)吸附實驗結(jié)果如圖4b所示,從圖中可以看出,DP-COF@MIPs可在90 min內(nèi)吸附達(dá)到平衡。DP-COF@MIPs對NFX的吸附量Q約為DP-COF@NIPs的3.6倍。

采用偽一級(公式(2))和偽二級(公式(3))動力學(xué)模型對動態(tài)吸附實驗結(jié)果進行擬合。

ln (Qe-Qt)=lnQ-k1t

(2)

(3)

式中,Qe(mg/g)、Qt(mg/g)分別為材料在吸附平衡和時間t時吸附NFX的量;k1(g/(mg·min))為偽一級吸附速率常數(shù),k2(g/(mg·min))為偽二級吸附速率常數(shù)。

對比圖4c和圖4d, DP-COF@MIPs和DP-COF@NIPs的動力學(xué)吸附更適合偽二級吸附模型(相關(guān)系數(shù)(r2)>0.93)。說明DP-COF@MIPs和DP-COF@NIPs的吸附過程主要受化學(xué)吸附控制。進一步利用Scatchard方程(公式(4))計算DP-COF@MIPs的表觀最大吸附量。

(4)

其中,Qe(mg/g)為平衡吸附量;Qmax(mg/g)為表觀最大吸附量;C(mg/L)為平衡濃度;Kd(mg/L)為解離常數(shù)。圖4e顯示DP-COF@MIPs和DP-COF@NIPs的Q隨著NFX初始濃度C0的增加而增加。在各濃度下DP-COF@MIPs對NFX的吸附量Q都遠(yuǎn)高于DP-COF@NIPs,證實DP-COF@MIPs對NFX良好的特異性結(jié)合能力。

如圖4f所示,DP-COF@MIPs的熱力學(xué)吸附數(shù)據(jù)經(jīng)Scatchard方程擬合,得到了2條直線,這意味著該材料對NFX存在著高、低兩種不同親和位點。依據(jù)斜率和截距,可計算出高親和力結(jié)合位點的Qmax和Kd分別為41.57 mg/g和187.62 mg/mL,低親和力(非特異性)結(jié)合位點的Qmax和Kd分別為22.54 mg/g和23.96 mg/mL。值得注意的是,本工作所制備的DP-COF@MIPs表現(xiàn)出優(yōu)異的吸附性能,其對NFX的Qmax分別為核殼結(jié)構(gòu)MIPs的4.83倍[1],多孔粒子的1.54倍[28]和中空纖維的8.48倍[29]。

為進一步研究DP-COF@MIPs的選擇性和特異性,選擇我國家禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用的CPFX、DMZ、OTC、SDZ和CAP等廣譜抗菌劑作為干擾物。其中CPFX也是氟喹諾酮類抗菌劑,是NFX的結(jié)構(gòu)類似物(見圖5)。將DP-COF@MIPs分別處理上述6種藥物,測定吸附量。由圖6a可見,DP-COF@MIPs對NFX的結(jié)合量在6種藥物中最高,是其結(jié)構(gòu)類似物CPFX的3倍,CAP的95倍。以上結(jié)果證明DP-COF@MIPs具有出色的立體選擇性。

圖 5 諾氟沙星和干擾物(環(huán)丙沙星、二甲硝咪唑、土霉素、磺胺嘧啶、氯霉素)的結(jié)構(gòu)Fig. 5 Structures of NFX and interferents (ciprofloxacin, dimetridazole, oxytetracycline, sulfadiazine and chloramphenicol)

為評價對NFX的特異性,采用DP-COF@MIPs處理含等濃度上述6種藥物的標(biāo)準(zhǔn)混合液,并使用LC-2030 Plus HPLC儀對洗脫液進行分析,所得典型色譜圖列于圖6b。由圖6b可知,所用色譜條件可以實現(xiàn)6種藥物的完全分離。經(jīng)DP-COF@MIPs處理后,在洗脫液中僅能觀察到NFX及其結(jié)構(gòu)類似物CPFX對應(yīng)的色譜峰,且NFX峰強度遠(yuǎn)高于CPFX。與之相比,DP-COF@NIPs洗脫液中幾乎觀察不到任何峰。上述結(jié)果說明DP-COF@MIPs對NFX具有良好的識別能力。

2.3 重復(fù)使用性

對該材料的重復(fù)使用性進行了評價。連續(xù)使用7次后,DP-COF@MIPs對NFX的吸附量仍保持在初始吸附量的95.3%以上,以上結(jié)果證實該材料具有良好的重復(fù)使用性。

2.4 實際樣本的測定結(jié)果

首先建立了Waters 1525 HPLC儀測定NFX的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程y=5.12×105x+1.15×104(r2=0.999),線性范圍在0.02～ 5 mg/L之間,檢出限為0.005 mg/L(S/N=3)。然后對加標(biāo)牛奶樣本進行了分析。未加標(biāo)牛奶、加標(biāo)牛奶(0.30 mg/L)、上清液和洗脫液的典型色譜圖見圖7。通過對HPLC譜圖對比分析,可以發(fā)現(xiàn)DP-COF@MIPs可以顯著降低基質(zhì)效應(yīng),實現(xiàn)牛奶中NFX的準(zhǔn)確測定。三水平加標(biāo)試驗結(jié)果進一步證實了該方法的可靠性(見表1)。將所建立的方法應(yīng)用于NFX含量低至0.002 0 mg/L的牛奶樣本的測定,平均回收率仍可達(dá)到77.6%(RSD 6.4%,n=3)。該濃度不僅低于所用Waters 1525型HPLC的檢出限(0.005 mg/L)，還僅為MRL(EU)的1/50。上述實驗結(jié)果證實所制備的DP-COF@MIPs可應(yīng)用于實際樣本中微量NFX的高選擇性富集。

圖 6 (a)DP-COF@MIPs、DP-COF@NIPs對諾氟沙星和干擾物的吸附量對比(n=3)和(b)競爭性吸附實驗的液相色譜圖Fig. 6 (a) Adsorption comparison of DP-COF@MIPs and DP-COF@NIPs toward NFX, CPFX, DMZ, OTC, SDZ, and CAP (n=3), and (b) typical chromatograms of competitive adsorption testsⅠ. mixed solution; Ⅱ. eluent of DP-COF@MIPs; Ⅲ. eluent of DP-COF@NIPs. CPFX: ciprofloxacin; DMZ: dimetridazole; OTC: oxytetracycline; SDZ: sulfadiazine; CAP: chloramphenicol.

圖 7 牛奶樣品的HPLC圖譜Fig. 7 Typical chromatograms of a milk sample a. blank sample; b. NFX-spiked (0.30 mg/L) sample; c. supernatant after treatment with DP-COF@MIPs; d. eluent of DP-COF@MIPs.

表 1 諾氟沙星在牛奶中3個水平下的加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 Recoveries of NFX in milk sample at three spiked levels (n=3)

3 結(jié)論

本文提出了一種在溫和條件下快速制備DP-COF@MIPs的方法,所制備出的DP-COF@MIPs對目標(biāo)分子表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性和特異性,并且具有柱容量高、重復(fù)使用性良好的特點,成功實現(xiàn)了實際樣本中痕量NFX的檢測。