侯秀丹, 于 輝, 朱 風(fēng), 李兆杰, 楊慶利*

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266109;2. 青島市即墨區(qū)綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心, 山東 青島 266200)

有機(jī)磷農(nóng)藥是一類含磷的有機(jī)化合物,具有高效的殺蟲效果,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用,但過量的殘留會(huì)引起水、空氣、土壤以及蔬菜、水果和加工食品的污染,對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成極大的傷害[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)因食用農(nóng)藥污染的食品而引起中毒的人數(shù)約占食物中毒總?cè)藬?shù)的1/3,其中有機(jī)磷農(nóng)藥引起的食物中毒現(xiàn)象占據(jù)我國(guó)農(nóng)藥食物中毒的第一位。目前有機(jī)磷農(nóng)藥的國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、檢出限高等問題[2]。因此,開發(fā)針對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、檢出限低的分析方法對(duì)保障食品安全具有重要意義[3]。

有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法等[4,5]。由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性、成分的多樣性以及農(nóng)藥殘留的痕量性,儀器很難直接檢測(cè)到食品中痕量的有機(jī)磷農(nóng)藥。為了提高靈敏度和準(zhǔn)確性,有必要采用合適的樣品前處理方法對(duì)其分離富集,然后進(jìn)樣檢測(cè)[6,7]。近年來,有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)中使用的基于納米材料的萃取方法,主要包括分散液液萃取、中空纖維液相萃取、分散固相萃取、磁固相萃取等[8-12];使用的納米材料主要包括金屬有機(jī)框架材料、共價(jià)有機(jī)框架材料、離子液體、金屬硫化物等[13-17]。

固相萃取作為一種高效的樣品前處理技術(shù),它實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量分析物富集濃縮的同時(shí),還可以去除樣品基質(zhì),消除干擾[18-21]。石墨烯自問世以來,在樣品前處理領(lǐng)域得到極大關(guān)注[22],之前有研究[23]將石墨烯納米片直接填充于帶有篩板的固相萃取小柱中,但是分散無基體支撐的石墨烯納米片容易破碎,堵塞篩板。也有一些研究[24]將石墨烯固定到硅膠載體上,但方法相對(duì)繁瑣,組裝量較少。最近,有機(jī)和無機(jī)氣凝膠材料受到很大關(guān)注[25,26],石墨烯氣凝膠作為一種三維石墨烯材料,自問世以來,由于超大的比表面積、良好的機(jī)械性能、極大的孔隙率、極低的密度等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于不同研究領(lǐng)域中[27-32]。石墨烯氣凝膠具有彈性,機(jī)械強(qiáng)度強(qiáng),可作為吸附劑被直接填充于固相萃取小柱中,不易破碎;除此之外,石墨烯氣凝膠具有三維框架結(jié)構(gòu),一定程度上可以避免石墨烯片層之間的堆積。

本實(shí)驗(yàn)以氧化石墨烯氣凝膠為吸附劑構(gòu)建固相萃取體系,建立了一種對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥高效的樣品前處理方法,結(jié)合HPLC-DAD,對(duì)蘋果皮中4種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行萃取檢測(cè),并通過考察加標(biāo)回收率,分析食品中基質(zhì)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UltiMate3000高效液相色譜儀配有高壓四元泵、自動(dòng)脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器(美國(guó)Thermo公司); Nicolet Nexus 870傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司); JSM-6701F掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社); SPE-80數(shù)控固相萃取儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司); Millipore Direct-Q純水儀(18.2 MΩ·cm,美國(guó)默克密理博公司); New Classic MF分析天平(天津市德安特傳感技術(shù)有限公司); KQ-500TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); TGL-16GB高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠); FW-80高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

辛硫磷、雙硫磷、倍硫磷、殺螟硫磷(純度>99%,上海阿拉丁試劑公司);石墨粉、五氧化二磷購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;甲醇、乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);過硫酸鉀(天津市巴斯夫化工有限公司);濃硫酸、高錳酸鉀、鹽酸(萊陽(yáng)市康德化工有限公司); 30%過氧化氫(西隴化工試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1材料的制備

采用Hummers法[9]對(duì)天然石墨粉進(jìn)行一系列處理制備得到氧化石墨烯。將10 g五氧化二磷和10 g過硫酸鉀混合加入錐形瓶中,加熱至80 ℃,再加入60 mL硫酸,持續(xù)一段時(shí)間后,加入40 g石墨粉,繼續(xù)加熱2 h,冷卻至室溫,抽濾。將20 mL硫酸加入到容積為2 L的大燒杯中,保持10 ℃以下加入2 g抽濾好的石墨,再加入1 g硝酸鈉,1 h后進(jìn)行超聲處理。30 min后,加入3 g高錳酸鉀,保持低溫2 h。超聲處理30 min后,加入200 mL蒸餾水,保持95 ℃ 20 min。加入150 mL超純水、30 mL過氧化氫、80 mL鹽酸,保持20 min,然后離心(5 000 r/min)10 min,倒入2 L超純水中,得到氧化石墨烯懸浮液。

將上述得到的氧化石墨烯懸浮液放入-80 ℃超低溫冰箱中冷凍2 h,隨后轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中,在20 Pa、-50 ℃條件下經(jīng)8 h后得到氧化石墨烯氣凝膠。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的儲(chǔ)備液均由甲醇配制,質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL,置于4 ℃冰箱中保存。使用之前,采用一級(jí)蒸餾水將儲(chǔ)備液稀釋至0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L,配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3樣品前處理

從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)(中國(guó)青島)購(gòu)買了煙臺(tái)紅富士蘋果。首先,使用高速粉碎機(jī)將蘋果皮粉碎成粉末,將1 g蘋果皮粉末置于10 mL乙醇-水(70∶30, v/v)中,于55 ℃超聲萃取3 h。之后,通過離心將蘋果皮和萃取劑分離,將萃取劑在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)。最后,將殘留物用20 mL超純水重溶,以進(jìn)行萃取。

1.2.4固相萃取過程

將5 mg氧化石墨烯氣凝膠填充于3 mL固相萃取空柱中,利用篩板將其固定。首先,使用5 mL乙腈和5 mL水依次通過固相萃取小柱淋洗活化材料,移取15 mL樣品溶液以1.0 mL/min流速進(jìn)行上樣;完成上樣過程后,用0.5 mL水將吸附在萃取劑表面的雜質(zhì)沖洗下來,然后將萃取小柱置于空氣中干燥5 min,隨即利用1.0 mL乙腈以0.6 mL/min的速率對(duì)吸附在萃取材料上的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行洗脫,進(jìn)HPLC檢測(cè)分析。保證相同的條件,每個(gè)過程重復(fù)3次,最后結(jié)果取平均值。

1.2.5色譜條件

分析柱為Hypersil ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫箱溫度為25 ℃。流動(dòng)相用超純水作為水相(A),甲醇作為有機(jī)相(B);流速為1 mL/min。采用梯度洗脫,具體條件為:0～12 min, 73%B; 12～13 min, 73%B～78%B。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為230 nm,樣品定量環(huán)為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

通過掃描電鏡觀察氧化石墨烯氣凝膠的表面形貌(見圖1),可以看出,所制備的氧化石墨烯氣凝膠表面呈現(xiàn)出層狀褶皺的結(jié)構(gòu),可見石墨烯的片層結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)使材料本身有較大的表面積,有利于萃取效率的提高。實(shí)驗(yàn)進(jìn)而表征了所制備的氧化石墨烯氣凝膠的BET表面積,氧化石墨烯氣凝膠的表面積、孔體積和平均寬度分別為740.51 m2/g、0.77 cm3/g和4.17 nm。

圖 1 氧化石墨烯氣凝膠在不同放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖Fig. 1 Scanning electron microscope images of graphene oxide aerogel with different magnifications

除此之外,對(duì)所制備的氧化石墨烯氣凝膠進(jìn)行了傅里葉紅外光譜測(cè)定,結(jié)果如圖2所示。從圖中可見,3 183 cm-1處的峰是氧化石墨烯表面含氧官能團(tuán)中O-H的伸縮振動(dòng)峰,2 823 cm-1和1 418 cm-1處的峰分別對(duì)應(yīng)的是氧化石墨烯邊緣=C-H的伸縮振動(dòng)峰和彎曲振動(dòng)峰,1 720 cm-1處的峰對(duì)應(yīng)的是羧基上C=O的伸縮振動(dòng)峰,1 622 cm-1處的峰是氧化石墨烯片層平面上C=C的伸縮振動(dòng)峰,1 043 cm-1處的峰是C-O的伸縮振動(dòng)峰。從中可見氧化石墨烯氣凝膠表面的多個(gè)含氧官能團(tuán)未因冷凍被破壞,其極性特征有利于萃取有機(jī)磷農(nóng)藥。

圖 2 氧化石墨烯氣凝膠的紅外光譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of graphene oxide aerogel

圖 3 實(shí)驗(yàn)條件對(duì)萃取回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of experimental parameters on the extraction recoveries (n=3)a. volume of sample; b. rate of sample loading; c. pH of sample; d. type of eluent; e. volume of eluent; f. extraction materials.

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

以4種有機(jī)磷農(nóng)藥(辛硫磷、雙硫磷、倍硫磷、殺螟硫磷)為考察對(duì)象,為獲得較優(yōu)的萃取效果,依次對(duì)萃取和洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化,包括上樣體積、上樣速率、溶液pH值及洗脫劑類型和體積。實(shí)驗(yàn)是在保證其他條件不變的前提下,對(duì)其中一個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1上樣體積

萃取過程中,在萃取材料保持質(zhì)量不變的條件下,萃取材料的吸附位點(diǎn)有限,過多的分析物會(huì)引起萃取回收率的降低。在本實(shí)驗(yàn)中,有機(jī)磷農(nóng)藥工作溶液的質(zhì)量濃度為200 μg/L,依次考察了上樣體積為5、10、15、20、40、60 mL時(shí)有機(jī)磷農(nóng)藥的萃取回收率。從圖3a中可以看出,當(dāng)上樣體積低于15 mL時(shí),萃取回收率保持較高值,之后萃取回收率明顯降低,所以將此實(shí)驗(yàn)的上樣體積選擇為15 mL。

2.2.2上樣速率

上樣速率對(duì)萃取回收率的影響也是雙向的,上樣太快會(huì)使得分析物與萃取材料之間接觸不充分,太慢會(huì)出現(xiàn)分析物被重新洗脫的現(xiàn)象,且造成操作時(shí)間過長(zhǎng)。此實(shí)驗(yàn)考察了0.8～3.0 mL/min的上樣速率,如圖3b顯示,在1.0 mL/min的條件下,萃取回收率達(dá)到最大值。

2.2.3溶液pH值

工作溶液的pH值不僅會(huì)影響樣品分子的存在狀態(tài),也會(huì)影響萃取材料表面的電荷,所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)工作溶液的pH值也進(jìn)行了考察。從圖3c中可以看出,樣品溶液處于酸性和堿性條件下,萃取回收率較高,這是因?yàn)樵谒釅A性條件下,有機(jī)磷農(nóng)藥分子與氧化石墨烯氣凝膠之間更容易形成氫鍵;而且在酸性條件下更有利于有機(jī)磷農(nóng)藥分子與氧化石墨烯氣凝膠之間靜電作用的形成,但pH值太低會(huì)造成有機(jī)磷農(nóng)藥不易從樣品溶液中分離出來,所以萃取回收率隨著酸度的降低會(huì)升高,從結(jié)果中可見,樣品溶液pH為4時(shí)萃取回收率最大。

表 1 有機(jī)磷農(nóng)藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r2), limits of detections (LODs),limits of quantifications (LOQs) and RSDs of the organophosphorus pesticides

2.2.4洗脫劑類型和體積

洗脫劑的選擇是實(shí)驗(yàn)參數(shù)中重要的環(huán)節(jié),它由分析物溶解性及其與萃取材料之間的作用力決定。此實(shí)驗(yàn)分別選擇了乙腈、甲醇、丙酮對(duì)其進(jìn)行洗脫,結(jié)果顯示乙腈的洗脫效果最好(見圖3d)。乙腈作為有機(jī)溶劑,為防止對(duì)環(huán)境的污染，應(yīng)盡可能少用,節(jié)約溶劑的同時(shí),對(duì)分析物富集倍數(shù)也會(huì)提高,但乙腈必須足夠才能保證將有機(jī)磷農(nóng)藥充分洗脫下來。此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了乙腈的體積對(duì)萃取回收率的影響,從圖3e中可以看出,當(dāng)乙腈體積高于1.0 mL時(shí),回收率較高且變化不大,但當(dāng)?shù)陀?.0 mL時(shí),回收率較低,所以選擇1.0 mL乙腈進(jìn)行洗脫。

2.3 萃取性能研究

實(shí)驗(yàn)將氧化石墨烯氣凝膠填充的固相萃取小柱與商用C18硅膠、氨基柱(-NH2)、陽(yáng)離子交換柱(SAX)、硅酸鎂柱(Florisil)(50 mg)等的萃取能力進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3f所示。從圖中看到,氧化石墨烯氣凝膠對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥分子的萃取效率要明顯高于商用材料,這歸功于氧化石墨烯氣凝膠的高比表面積和優(yōu)良的吸附能力,除此之外,氧化石墨烯與有機(jī)磷農(nóng)藥分子之間的氫鍵、π-π和靜電作用也提高了其萃取能力。基于氧化石墨烯氣凝膠的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和吸附特性,此萃取柱具有一定通用性,也可用于一些其他極性或弱極性污染物的萃取。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了制備的萃取柱的壽命。將其連續(xù)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥萃取洗脫25次,使用次數(shù)與萃取回收率的關(guān)系如圖4所示,萃取柱使用15次后,有機(jī)磷農(nóng)藥分子的萃取回收率有所降低。因此,該萃取柱使用15次后將其丟棄。

圖 4 氧化石墨烯氣凝膠萃取柱的使用壽命(n=3)Fig. 4 Service life of graphene oxide aerogel-based extraction column (n=3)

圖 5 實(shí)際樣品及加標(biāo)樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of a real sample and spiked samples

2.4 方法學(xué)考察

配制一系列不同濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥混合工作溶液,在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,采用氧化石墨烯氣凝膠固相萃取柱對(duì)上述工作溶液中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行萃取,并結(jié)合HPLC-DAD對(duì)分析物進(jìn)行分離檢測(cè)。結(jié)果列入表1中,從中可見本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有良好的線性范圍:1～200 μg/L(辛硫磷、雙硫磷、倍硫磷)和2～200 μg/L(殺螟硫磷),且線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99,檢出限≤0.5 μg/L。單根萃取小柱連續(xù)萃取5次,有機(jī)磷農(nóng)藥的萃取回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤6.5%,然后使用5根萃取小柱萃取分析物,萃取回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤11.3%。

2.5 實(shí)際樣品應(yīng)用

將本實(shí)驗(yàn)建立的方法應(yīng)用于蘋果皮中有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)分析,選擇3個(gè)蘋果進(jìn)行分析,每個(gè)水平做3個(gè)平行樣品。從圖5中可見,在所選的蘋果皮中未檢測(cè)到4種有機(jī)磷農(nóng)藥的存在,隨后為考察基質(zhì)效應(yīng)對(duì)所制備的萃取材料性能的影響,在樣品中分別加入20、50和100 μg/L的有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液,從表2中可見,所得加標(biāo)回收率為70.5%～93.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10.4%,可以看出在氧化石墨烯氣凝膠固相萃取柱-高效液相色譜法檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的過程中,實(shí)際樣品中的基質(zhì)對(duì)其干擾較小。

表 2 蘋果皮中有機(jī)磷農(nóng)藥的含量、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 2 Contents, spiked recoveries and RSDs of organophosphorus pesticides in apple skin (n=3)

3 結(jié)論

本工作通過冷凍干燥成功制備了氧化石墨烯氣凝膠吸附劑,建立了固相萃取-高效液相色譜測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥的方法。本方法操作簡(jiǎn)單,線性范圍寬,檢出限低,在實(shí)際樣品中的應(yīng)用表明氧化石墨烯氣凝膠適用于富集食物樣品中痕量有機(jī)磷農(nóng)藥,對(duì)一些弱極性或極性的其他污染物也存在萃取潛力。