譚學(xué)蓉, 趙 斌, 陸建偉, 劉少穎, 茍薇妮, 楊 容, 佐 鵬

(1. 廣元市疾病預(yù)防控制中心, 四川 廣元 628000; 2. 杭州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 杭州 310006)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是一類外源性化學(xué)物質(zhì),由于其可通過干擾生物或人體內(nèi)保持自身平衡和調(diào)節(jié)發(fā)育過程天然激素的合成、分泌、運輸、結(jié)合、反應(yīng)和代謝等過程,從而對生物或人體的生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等的功能產(chǎn)生影響,近年來被科學(xué)界廣泛關(guān)注[1,2]。雙酚類物質(zhì)(bisphenols, BPs)是典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,主要包含雙酚A(BPA)、雙酚S(BPS)、雙酚Z(BPZ)、雙酚P(BPP)、雙酚AF(BPAF)、雙酚F(BPF)、雙酚B(BPB)和雙酚AP(BPAP)等[3]。

BPs是重要的有機(jī)化工原料,用于合成聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂、聚砜樹脂等高分子材料,在涂料、膜材料、光電科技、包裝材料及其他日用品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[4,5]。在這些產(chǎn)品制造、使用、老化和處置過程中,BPs會釋放到環(huán)境中,對人體產(chǎn)生危害。BPs具有雌激素效應(yīng),能與多種內(nèi)源性受體相互作用,如甲狀腺激素[6,7]、糖皮質(zhì)激素[8]、雄激素和雌激素受體[9-11],對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。報道[12-15]還表明,BPs對哺乳動物和魚類等均具有明顯的神經(jīng)毒性,能夠影響神經(jīng)功能及神經(jīng)遞質(zhì)含量等。近年來,世界各地的環(huán)境基質(zhì)[16,17]、食品基質(zhì)[18]、飲用水[19]和人體生物樣本[20]中均有BPs被檢出的報道。我國多個河流被報道檢測出雙酚A,龔劍等[21]檢測出珠江廣州河段表層水中雙酚A的含量為97.8～540.6 ng/L, Bian等[22]對長江河口和東海入海口進(jìn)行了雙酚A的測定,發(fā)現(xiàn)在上層底泥中其含量為0.7～13.2 ng/g。

BPs主要檢測方法包括液相色譜法[23]、液相色譜-質(zhì)譜法[24]、氣相色譜-質(zhì)譜法[25]等。隨著居民飲食安全意識的提高和對水中BPs污染狀況的關(guān)注,建立水中BPs的高靈敏度、高選擇性、高通量檢測分析方法變得越來越迫切。色譜與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用具有高靈敏度及高選擇性等優(yōu)點,是最常用的檢測技術(shù)。但水樣中BPs的含量處于ng/L水平,需要對樣品進(jìn)行前處理,以達(dá)到富集和凈化的目的[26]。傳統(tǒng)的液液萃取耗費大量有機(jī)溶劑,且耗時長,靈敏度低;固相萃取是最常用的前處理方式,具有純化效果好、濃縮倍數(shù)大、重現(xiàn)性好、自動化操作程度高等優(yōu)點,但處理步驟較復(fù)雜,成本高。QuEChERS方法簡單,試劑用量少,樣品損失少,回收率高,成本低廉。

本研究基于QuEChERS前處理技術(shù),選用乙酸乙酯為提取劑,N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化炭黑(GCB)為凈化劑,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù),實現(xiàn)了地表水中8種BPs的快速定性和定量。該方法具有簡便、快捷、靈敏度高和成本低廉等優(yōu)勢,能快速富集與凈化水中BPs。最后,運用此方法檢測嘉陵江廣元段及其支流中BPs的污染狀況,證明該方法適用于地表水中8種BPs的痕量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 4500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司); HAC-24A氮吹濃縮儀(天津市恒奧科技公司); HR/T20MM高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司)。雙酚A(純度98%)、雙酚S(純度98%)、雙酚Z(純度99%)、六氟雙酚A(純度95%)、雙酚F(純度95%)、雙酚B(純度95%)和雙酚AP(純度95%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;雙酚P(純度95%)、乙酸(分析純)、無水硫酸鎂(MgSO4,分析純)和乙酸鈉(NaAC,分析純)均購自美國Sigma-Aldrich公司;PSA、GCB和C18均購自美國Agilent公司;甲醇、乙腈和乙酸乙酯均為農(nóng)殘級,購自美國J. T. Baker公司。

準(zhǔn)確稱取8種BPs各100 mg,分別用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃保存。

分別移取適量上述8種單標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇配制混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,其中BPA、BPZ、BPAP和BPAF質(zhì)量濃度為50 mg/L, BPF、BPP和BPB質(zhì)量濃度為100 mg/L, BPS質(zhì)量濃度為10 mg/L;用甲醇-水(1∶1, v/v)對上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間液進(jìn)行逐級稀釋,配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品采集

根據(jù)HJ/T 91-2002,對廣元市境內(nèi)嘉陵江、白龍江、南河3條河流分上、中、下游3個斷面監(jiān)測布點。嘉陵江上游斷面設(shè)在廣元市朝天區(qū)大灘鎮(zhèn)小河口,斷面編號J1;中游斷面設(shè)在廣元市利州區(qū)澳援大橋,斷面編號J2;下游斷面設(shè)在蒼溪縣陵江鎮(zhèn)百利村,斷面編號J3。白龍江上游斷面設(shè)在廣元市青川縣姚渡大橋，斷面編號B1；白龍江中游斷面設(shè)在廣元市利州區(qū)三堆鎮(zhèn)，斷面編號B2；白龍江下游斷面設(shè)在廣元市昭化區(qū)兩河口，斷面編號B3。南河上游斷面設(shè)在廣元市利州區(qū)和平村,斷面編號N1;中游斷面設(shè)在廣元市利州區(qū)龍洞碥大橋,斷面編號N2;下游斷面設(shè)在利州區(qū)天成大橋,斷面編號N3,詳見圖1。各橫斷面設(shè)置6個采樣點(兩岸對稱設(shè)點,每個采樣點間隔50 m),使用不銹鋼采水器采集0.5 L表層河水(距離河岸1.5 m,河面下0.5 m),共采集54份，分別裝入玻璃瓶中,冷藏運輸,保存于4 ℃冰箱,待測。

圖 1 河流采樣斷面分布圖Fig. 1 Distribution map of river sampling section This map was made based on the standard map [(2016) 018] downloaded from the standard map service website of Sichuan Bureau of Surveying, Mapping and Geoinformation. The base map had no modification.

圖 2 采用不同色譜柱時8種BPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms of the eight BPs in mixed standard solutions using different chromatographic columns1. BPS; 2. BPF; 3. BPA; 4. BPB; 5. BPAF; 6. BPAP; 7. BPZ; 8. BPP.Contents: 2.5 ng/mL of BPA, BPZ, BPAP and BPAF, 5.0 ng/mL of BPF, BPP and BPB, and 0.5 ng/mL of BPB; mobile phase: methanol-water; column temperature: 30 ℃.

1.2.2樣品前處理

移取40 mL水樣,置于50 mL比色管中,加入10 mL乙酸乙酯,劇烈搖蕩,提取10 min，靜置5 min,取有機(jī)層于15 mL聚丙烯(PP)離心管中,加入50 mg PSA和50 mg GCB凈化,以10 000 r/min離心5 min,取上清液于45 ℃下氮氣吹干,用0.5 mL甲醇-水(1∶1, v/v)溶解殘渣,待UPLC-MS/MS測定。

1.2.3分析條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫40 ℃;流動相A甲醇;流動相B 0.1 mmol/L碳酸氫銨水溶液;流速0.3 mL/min。梯度洗脫條件:0～0.5 min, 30%A; 0.5～4.0 min, 30%A～95%A; 4.0～6.0 min, 95%A; 6.0～7.0 min, 95%A～30%A; 7.0～8.0 min, 30%A。進(jìn)樣體積5 μL。

電噴霧電離(ESI)源,負(fù)離子掃描模式;離子源溫度600 ℃;離子化電壓(IS), -4 500 V;去簇電壓-85.0 V;氣簾氣(CUR)壓力172.4 Pa;噴霧氣(GS1)壓力379.2 Pa;輔助加熱氣(GS2)壓力379.2 Pa;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。8種BPs的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 MRM模式下8種BPs的保留時間與質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS/MS parameters for the eight bisphenols (BPs) in MRM mode

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS條件的優(yōu)化

取500 ng/mL 8種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別以自動進(jìn)樣的方式在全掃檢測模式下進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。結(jié)果表明,8種BPs在ESI-模式下得到的[M-H]-離子峰的響應(yīng)值更佳。通過子離子掃描得到目標(biāo)物碎片離子信息,選擇響應(yīng)最強的產(chǎn)物離子和次強的產(chǎn)物離子分別作為8種BPs的定量離子(quantitative ion)和定性離子(qualitative ion),并對去簇電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化結(jié)果見表1。

取8種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以甲醇和水為流動相,按1.2.3節(jié)梯度洗脫程序,在保持濃度、流速、進(jìn)樣量等參數(shù)一致的條件下,分別考察了用亞乙基橋雜化顆粒填充的Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和用高強度硅膠顆粒填充的Waters ACQUITY HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)對目標(biāo)物色譜峰形、離子化效率和保留時間的影響(見圖2)。結(jié)果表明,BPF、BPAF、BPAP和BPZ在C18柱上能獲得更好的峰形和檢測靈敏度,故選擇C18柱為分析柱。

圖 3 8種BPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion chromatogram of the eight BPs in mixed standard solution 1. BPS; 2. BPF; 3. BPA; 4. BPB; 5. BPAF; 6. BPAP; 7. BPZ; 8. BPP.Contents: 2.5 ng/mL of BPA, BPZ, BPAP and BPAF; 5.0 ng/mL of BPF, BPP and BPB; and 0.5 ng/mL of BPB.

實驗同時還對流動相種類、流速、柱溫及梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化,最終采用甲醇和0.1 mmol/L碳酸氫銨水溶液作為流動相。流動相中加入碳酸氫銨有助于化合物的離子化,使目標(biāo)物響應(yīng)增大,提高靈敏度。在最優(yōu)條件下得到的8種目標(biāo)化合物的總離子流色譜圖見圖3,可以看出,8種BPs在8 min內(nèi)可較好分離。

2.2 QuEChERS方法的優(yōu)化

本研究選用乙酸乙酯作為提取溶劑,將8種BPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到40 mL河水中,使得BPA、BPZ、BPAP和BPAF質(zhì)量濃度為2.5 ng/mL, BPF、BPP和BPB質(zhì)量濃度為5.0 ng/mL, BPS質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL,以此為例優(yōu)化QuEChERS方法。每次試驗均平行3次,以檢驗方法的重復(fù)性。

2.2.1提取液的優(yōu)化

實驗在保持其他條件一致的情況下,以1 g NaAC+4 g MgSO4為萃取鹽,比較了含1%(v/v)甲酸的乙酸乙酯溶液、含1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯溶液,以及純乙酸乙酯對提取效果的影響。結(jié)果表明,是否加酸對8種目標(biāo)物的提取效果影響不明顯,故本研究中提取液不加酸,用乙酸乙酯提取。

實驗在保持其他條件一致的情況下,采用乙酸乙酯提取,以不加鹽的空白組為對照,考察5 g NaAC、1 g NaAC+4 g MgSO4和5 g MgSO4萃取鹽對提取效果的影響。結(jié)果表明,與加鹽的組別相比,不加鹽的對照組8種BPs的響應(yīng)值更高(見圖4)。故本研究中提取液不加鹽。

圖 4 不同萃取鹽對8種BPs響應(yīng)強度的影響(n=3)Fig. 4 Effects of different extraction salts on the response strength of the eight BPs (n=3)

2.2.2凈化劑的優(yōu)化

提取方法的優(yōu)化以過程效率(process efficiency, PE)最大化為基礎(chǔ),它考慮了樣品處理過程中的基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME),評估了樣品處理程序中分析物損失對分析物信號的影響,即回收效率(recovery efficiency, RE)。其中,PE=RE×ME×100%; RE=C1/C2×100%; ME=C2/C3×100%(C1為樣品加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并經(jīng)程序處理得到的峰面積,C2為樣品經(jīng)程序處理之后加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得到的峰面積,C3為空白樣品經(jīng)程序處理之后加入標(biāo)準(zhǔn)得到的峰面積)[27,28]。ME評價基質(zhì)對被分析物信號的影響,包含3種情況:ME=100%,沒有任何影響;ME>100%,增強被分析物信號;ME<100%,抑制被分析物信號。

按照樣品前處理過程,以無吸附劑的空白組為對照,分別選取PSA、C18和GCB為凈化劑,比較不同吸附劑組合對RE、ME和PE的影響,結(jié)果見圖5。

圖 5 不同吸附劑對8種BPs(a)RE、(b)ME和(c)PE值的影響(n=3)Fig. 5 Effects of different adsorbents on the (a) recovery efficiency (RE), (b) matrix effect (ME) and (c) process efficiency (PE) values of the eight BPs (n=3)

圖5的結(jié)果顯示,不同種類的吸附劑對8種BPs的RE影響明顯,如僅使用GCB時,BPZ的RE為58.1%,但當(dāng)使用GCB+PSA時,其RE升高至71.6%。不同種類的吸附劑對目標(biāo)分析物的ME影響相對較小,大部分集中在90%～100%,以離子抑制效應(yīng)為主導(dǎo)。與對照組相比,大部分的吸附劑都能提高目標(biāo)分析物的RE和ME值。因此,為了提高樣品處理的回收效率,不可避免地需要凈化步驟。提取方法的優(yōu)化以過程效率PE最大化為最終目標(biāo),從圖5中可以看到,GCB+PSA為最優(yōu)組合,所以選擇GCB+PSA混合吸附劑作為本方法的凈化劑。

選取25 mg GCB+25 mg PSA、50 mg GCB+50 mg PSA和100 mg GCB+100 mg PSA對凈化劑用量進(jìn)行優(yōu)化。隨著凈化劑用量的增加,部分分析物的PE值被提高,但趨勢不明顯。綜合考慮8種目標(biāo)物的PE值,最終選擇50 mg GCB+50 mg PSA作為本研究的吸附劑。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍與檢出限

取7份空白河水,加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2.2節(jié)和1.2.3節(jié)步驟處理,分別以8種BPs的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制目標(biāo)分析物的基質(zhì)加標(biāo)校正曲線(見表2)。結(jié)果顯示,8種BPs在各自范圍內(nèi)均能獲得良好的線性關(guān)系,決定系數(shù)(R2)均大于0.999 0。以信噪比(S/N)=3和10確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。8種BPs的LOD為0.1～2.3 ng/L, LOQ為0.3～6.1 ng/L。

2.3.2回收率和精密度

取河水樣品40 mL,做3個水平的加標(biāo)回收試驗,每個添加水平做6次平行,計算各待測物的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。方法的平均加標(biāo)回收率為78.8%～116.6%, RSD為1.8%～9.0%,準(zhǔn)確度和精密度均符合HJ/T 91-2002《地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》要求。這表明該方法適用于分析湖泊、河水等地表水中8種BPs。

2.3.3與其他方法比較

表4列出了近兩年文獻(xiàn)中報道的測定水中BPs的前處理方法,并對各自性能做了簡單對比。固相萃取具有純化效果好、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,但處理步驟較復(fù)雜,成本高,部分化合物回收率低,如Zhang等[19]和Huang等[29]文獻(xiàn)中報道的部分化合物的回收率僅為57%和31%。采用GC-MS和GC-MS/MS分析BPs存在一定的局限性,如Skufca等[30]報道的方法,LOQ為10～30 ng/L,靈敏度低;Wang等[31]通過固相萃取和柱前衍生相結(jié)合的方式提高了方法的檢測靈敏度,但操作繁瑣。茍新磊等[32]利用真空冷凍干燥濃縮水樣,操作簡單,靈敏度高,回收率好,但方法中未添加凈化步驟,只適合基質(zhì)單一的瓶裝水。與以上方法相比,本研究中的QuEChERS方法操作簡單,試劑用量少,成本低廉,回收率高,結(jié)合UPLC-MS/MS,具有檢測靈敏度高、抗干擾能力強、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點。

表 2 8種BPs的線性范圍、線性方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, coefficient of determinations (R2), LODs and LOQs of the eight BPs

2.4 實際樣品的測定

通過分析來自嘉陵江廣元段及其支流54份地表水中目標(biāo)化合物的含量,進(jìn)一步驗證分析方法的適用性。實驗過程中,每一批樣品做3個程序空白實驗,計算樣品含量時扣除程序空白實驗中BPs的含量。

白龍江、嘉陵江和南河均檢出BPA和BPS,部分采樣點檢出微量的BPF、BPP和BPAP,但均低于檢出限,詳細(xì)的結(jié)果如表5所示。BPA在白龍江、嘉陵江和南河中的檢出率均為100%,其中南河的BPA含量最高(平均含量37.80 ng/L,含量范圍10.15 ～ 90.03 ng/L),而南河龍洞碥斷面(N2)檢出值居首,平均65.14 ng/L。此斷面上游有許多的小型工廠,排污口相對較多,且南河水量小,水流速度慢,自凈能力差,這可能是導(dǎo)致其BPA含量偏高的原因。BPS在白龍江、嘉陵江和南河中的檢出率分別為94%、78%和100%,其中嘉陵江中BPS的含量最高(平均含量1.05 ng/L,含量范圍nd～4.63 ng/L),而嘉陵江天成大橋斷面(J2)檢出值排第一,平均2.64 ng/L。此斷面橫穿人口稠密的廣元老城區(qū),又處在嘉陵江與南河交匯處的下游,生活污水導(dǎo)致BPS含量偏高。白龍江中BPA和BPS的平均含量分別為20.25 ng/L和0.54 ng/L,其遠(yuǎn)離市區(qū),水量相對充沛,故BPA和BPS含量相對較低。

3條河水中均檢出BPA和BPS,表明廣元及其周邊地區(qū)以BPA的使用為主。BPA在中國是一種高產(chǎn)量的化學(xué)品,產(chǎn)量約為16.7萬噸/年[34]。自2008年,中國開始規(guī)范BPA的生產(chǎn)和使用,其逐漸被BPS和BPF所取代。但廣元境內(nèi)河流未發(fā)現(xiàn)高濃度的BPS和BPF,仍然以BPA為主,且BPA的水平(6.15～90.03 ng/L)普遍低于其他河流,如遼河流域(4～141 ng/L)[35]、松花江(23～714 ng/L)[36]、珠江(43～639 ng/L)[37]等。這些結(jié)果表明BPs在全國不同地區(qū)的使用量存在明顯差異。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測地表水中8種BPs的分析方法。該方法具有簡便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好、回收率佳和成本低廉等優(yōu)勢,可用于湖泊、河流等地表水中痕量BPs的快速檢測,具有實際應(yīng)用價值。將該方法應(yīng)用于測定嘉陵江廣元段及其支流中BPs的含量,結(jié)果顯示污染物主要為BPA和BPS,存在影響人體健康的風(fēng)險,這些結(jié)果將為了解BPs在水環(huán)境中的污染情況提供有用信息。