李志東, 傅 青, 戴卓舜, 金 郁*, 梁鑫淼,2

(1. 華東理工大學藥學院制藥工程與過程化學教育部工程研究中心, 上海 200237;2. 中國科學院分離分析化學重點實驗室, 中國科學院大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023)

環(huán)孢素A(cyclosporine A, CsA)是由11個氨基酸組成的中性環(huán)狀多肽(見圖1),在臨床作為拮抗器官和組織移植后排異反應的首選藥物[1-3]。在CsA的分離檢測中,使用最廣泛的是高效液相色譜法(HPLC)[4,5]。依據(jù)CsA的脂溶性特點,HPLC分析時多采用反相C18固定相,流動相以乙腈-水、甲醇-水為主,添加乙酸銨、甲酸、磷酸、三氟乙酸等添加劑[6-11]。有文獻報道,CsA在HPLC中的保留時間隨著溫度升高沒有明顯降低。這是因為CsA具有獨特的環(huán)狀剛性結構,在高溫下的水溶劑化能力較差,所以流動相的洗脫能力并沒有隨著升溫而顯著提高,CsA的保留時間波動很小[12,13]。

已報道的CsA及其衍生物的純化方法包括了大孔樹脂、柱層析和高速逆流色譜等[14-16],發(fā)酵液經(jīng)過大孔樹脂處理后,可以達到去除雜質和富集環(huán)孢素的目的,而隨后采用硅膠柱層析或者高速逆流色譜法則可純化得到環(huán)孢素單體。為了進一步去除雜質,達到雜質的限量要求,同時提高上樣量、回收率等工藝參數(shù),更多先進的分離技術用于藥品的純化制備。制備高效液相色譜(prep-HPLC)具有柱效高、分離快速穩(wěn)定、在線檢測和自動收集的優(yōu)勢,已廣泛用于發(fā)酵來源的藥物和天然產(chǎn)物這類復雜樣品的分離純化。開展CsA的色譜行為研究,深入了解CsA的色譜特性,可為CsA制備方法的選擇與優(yōu)化提供理論上的指導。從影響反相液相色譜(RPLC)制備的關鍵因素出發(fā),本文系統(tǒng)開展了CsA在RPLC模式下的保留行為研究,包括考察有機溶劑種類和比例對CsA保留的影響,探索CsA峰形和上樣量之間的關系。并通過測定CsA的吸附等溫線,對其色譜行為給出理論上的支持?；谏鲜鼋Y果,嘗試開展CsA的純化分離,為prep-HPLC純化CsA提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Alliance高效液相色譜儀(Waters, USA),包括2695四元梯度泵、2489 UV-Vis檢測器、自動進樣器和柱恒溫系統(tǒng);XP105DR分析天平(Mettler Toledo, 瑞士)。環(huán)孢素A原料藥(純度>99%)和粗品為浙江瑞邦藥業(yè)有限公司提供,分別用于吸附量測定和分離純化實驗。

色譜級甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、甲基叔丁基醚、磷酸(H3PO4,純度>98%)購自百靈威(中國)科技有限公司;流動相水為娃哈哈純凈水,經(jīng)0.22 μm膜過濾。

1.2 實驗條件

1.2.1流動相體系對環(huán)孢素A保留的影響

稱取CsA原料藥適量,用甲醇溶解,配制質量濃度為10 g/L的樣品溶液,用0.22 μm膜過濾備用。C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 10 μm, 10 nm, 浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司);在甲醇-水和乙腈-水體系下采用等度洗脫,甲醇-水的比例分別為80/20、82/18、84/16、85/15、86/14、88/12、90/10 (v/v),乙腈-水的比例分別為60/40、65/35、70/30、75/25、80/20、85/15、90/10(v/v)。進樣量5 μL,流速1.0 mL/min;柱溫55 ℃,檢測波長203 nm。

1.2.2考察上樣量對環(huán)孢素A峰形的影響

分別稱取適量CsA溶于甲醇中,配成質量濃度為1、5、10、20和40 g/L的樣品溶液。流動相分別采用甲醇-水(88/12,86/14,84/16, v/v)及乙腈-水(85/15,80/20,75/25, v/v),其余條件同1.2.1。

1.2.3測定吸附等溫線

采用前沿吸附法測定吸附等溫線[17],以甲醇-水(84∶16)體系為例:(1)配制84%甲醇水溶液,過0.22 μm膜作為流動相A。(2)分別稱取25、250、1 250 mg CsA,充分溶解于A相溶液中,轉移至250.00 mL容量瓶中,用A相溶液定容至刻度線,分別得到樣品質量濃度為0.1、1、5 g/L的84%甲醇溶液,過0.22 μm膜,分別作為流動相B、C、D。

實驗方法(以甲醇-水體系為例) 色譜柱:C18 (50 mm×4.6 mm, 10 μm, 10 nm, 浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司),柱溫:55 ℃;流速:1.0 mL/min;用A相充分平衡,開始進樣,進樣體積設置為0 μL。依次設置流動相A、B、C和D的比例,以臺階梯度的方式改變流動相中CsA的濃度?？刂艬(C或D)的體積分數(shù)為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,對應流動相中樣品的質量濃度分別為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.1 g/L(C: 0.1～1 g/L, D: 0.5～5 g/L)。每個臺階梯度時間為10 min。為了使紫外檢測在線性范圍內(nèi),適當調(diào)整檢測波長,對應B、C、D相的檢測波長分別為230、245和255 nm,環(huán)孢素A的紫外光譜圖見圖2。在乙腈-水體系中的實驗方法同上。

死時間t0的測定 稱取KNO3適量,配制質量濃度為5 g/L KNO3溶液,過0.22 μm濾膜備用。分別在對應的流動相條件下進KNO3溶液,進樣體積10 μL;洗脫方式:0～1 min, 100%A,記錄KNO3出峰時間,重復3次,取平均,記為t0。

柱外流經(jīng)時間t1的測定 在對應的流動相條件下,取下色譜柱,用兩通連接兩端管路,洗脫方式:0～0.5 min, 100%A; 0.5～5 min, 100%B。取曲線上升到一半高度時的保留時間減去A相流經(jīng)的0.5 min即為柱外流經(jīng)時間t1(示意圖見圖3a)。重復3次,取平均值。

吸附量計算方法 采用中點法計算吸附量,見圖3b和公式(1)。

Δq=(t-t0-t2)vΔc/Va

(1)

其中Δq為吸附增量;t是對應濃度下的樣品突破時間,即讀取每個濃度下曲線上升到一半高度時對應的保留時間;t1是柱外流經(jīng)時間(見圖3a);t2表示對應濃度轉換的時間點,由設定的梯度條件決定,如本實驗中為10 min;v為流動相流速(量);Δc為每一階梯樣品濃度增量;Va表示色譜柱中固定相的體積。

圖 3 (a)柱外流經(jīng)時間t1和(b)吸附量增量Δq的計算方法圖Fig. 3 Calculated method plots for the determination of (a) extra-column flow time (t1) and (b) increased adsorption capacity (Δq) t0: dead time; t2: the time point of the corresponding concentration conversion, which is determined by the set gradient conditions; t: the breakthrough time of the sample at the corresponding concentration, which is the corresponding retention time when the curve rises to half of the height at each concentration.

1.2.4環(huán)孢素A的純化

稱取環(huán)孢素A粗品適量用甲醇溶解,配制質量濃度為500 g/L的樣品溶液,過0.22 μm膜。C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 10 nm, 10 μm);流動相組成:A為水,B為乙腈,梯度洗脫:0～60 min, 65%B～75%B; 60～80 min, 75%B;流速:0.6 mL/min;柱溫:55 ℃;檢測波長:203 nm,進樣量:30 μL;按照時間對色譜峰進行收集,每2 min收集一次。

餾分純度分析:Unitary C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 10 nm, 浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司),流動相:乙腈-水-磷酸-甲基叔丁基醚(490/460/1/50, v/v/v/v),等度洗脫,流速1.5 mL/min,柱溫60 ℃。

2 結果與討論

2.1 流動相種類與比例對環(huán)孢素A保留的影響

甲醇和乙腈是RPLC中兩種常用的洗脫劑。在C18固定相上,分別考察CsA在甲醇-水和乙腈-水兩種體系下的保留情況,流動相組成與保留因子(k)的關系見圖4。

圖 4 環(huán)孢素A在甲醇-水和乙腈-水流動相體系中的保留因子Fig. 4 Retention factors (k) of CsA in MeOH-H2O and ACN-H2O mobile phases C18 column (150 mm×4.6 mm, 10 mm); column temperature: 55 ℃; detection wavelength: 203 nm; flow rate: 1.0 mL/min.

圖 5 甲醇-水及乙腈-水流動相體系中環(huán)孢素A的峰形隨上樣量的變化Fig. 5 Change in the peak shape of CsA with increased sample loading in MeOH-H2O and ACN-H2O mobile phases C18 column (150 mm×4.6 mm, 10 μm); flow rate: 1.0 mL/min; column temperature: 55 ℃; detection wavelength: 203 nm; injection volume: 5 μL. Mobile phase: a1-a3: MeOH-H2O, 88/12, 86/14, and 84/16 (v/v); b1-b3: ACN-H2O, 85/15, 80/20 and 75/25 (v/v).Sample mass concentration: 1, 5, 10, 20 and 40 g/L.

在甲醇-水體系中,隨著甲醇比例降低,CsA的保留時間明顯增加。當甲醇-水的體積比為90/10時,k≈2,當調(diào)整為80/20時,k增加到18。對比84%、86%、88%甲醇的保留,甲醇每增加2%,k會增加3左右?？刂萍状急壤?4%～88%, CsA的k在3～7范圍內(nèi),保留適中。

在乙腈-水體系中,當乙腈比例由90%降低至65%, CsA的k由1增加至17左右。在乙腈比例改變5%的情況下(75%、80%、85%), CsA的k相差3左右,控制乙腈比例在75%～85%,k在3～6范圍內(nèi)。通過有機相比例對保留影響的考察,注意到CsA的保留對于有機相比例改變較為敏感,在有機相比例稍有變動時,保留相差較大,這就需要注意提高有機相比例控制的精度,才能保證分離的穩(wěn)定性。相對來講,乙腈比例改變對于CsA保留的影響不及甲醇那樣明顯。

2.2 上樣量對環(huán)孢素A峰形的影響

根據(jù)制備色譜的非線性理論,峰形是影響制備純度的關鍵因素。實驗分別考察了兩種流動相體系下CsA的峰形與上樣量之間的關系見圖5。無論是甲醇-水體系(圖5a1～a3),還是乙腈-水體系(圖5b1～b3),隨著上樣量的增加,CsA的峰形都由對稱開始變得拖尾。如果溶質保留時間長,拖尾現(xiàn)象尤其明顯,保留時間前移。此實驗結果提示,在進行CsA純化時,需要注意保留時間在目標物前的雜質(即前雜)的分離。根據(jù)制備色譜的非線性理論,隨著上樣量的增加,前雜會因為擠壓效應而影響主峰分離的純度。另外,兩種常用的有機相,無論是質子供體的甲醇,還是質子受體的乙腈,在所測試的濃度范圍內(nèi),在保留相當?shù)那闆r下,峰形和展寬程度是相似的,即無法通過改變有機相種類對峰形和展寬程度進行調(diào)節(jié)。

圖 6 環(huán)孢素A在(a)甲醇-水和(b)乙腈-水中的吸附等溫線Fig. 6 Adsorption isotherms of CsA in (a) MeOH-H2O and (b) ACN-H2O

圖 7 環(huán)孢素A在甲醇-水和乙腈-水流動相體系下的Scatchard分析圖Fig. 7 Scatchard plots of CsA in MeOH-H2O and ACN-H2O mobile phases

2.3 環(huán)孢素A的吸附等溫線

采用連續(xù)前沿吸附法,分別測定環(huán)孢素A在6種條件下的吸附等溫線(見圖6),其中,橫坐標表示流動相中溶質的質量濃度C(g/L),縱坐標表示溶質在固定相上的吸附量q(g/L)。在3種不同比例甲醇-水或者乙腈-水體系中,當流動相中CsA濃度較低時,有機相比例對樣品在固定相上的吸附量影響并不明顯,而當流動相中溶質質量濃度繼續(xù)增加到0.5 g/L以上時,如果流動相中有機相比例降低,CsA在固定相上的吸附量則逐漸增加。當流動相中的樣品質量濃度達到5 g/L時,在88%甲醇中,吸附量為24.9 g/L,而在84%甲醇中,吸附量增加至40.8 g/L(見圖6a)。在乙腈-水體系中,CsA在固定相上的吸附量比在甲醇-水體系中更大些。同樣在流動相中樣品質量濃度在5 g/L時,在75%乙腈中,吸附量增加至46.4 g/L(見圖6b)。當采用制備色譜進行純化時,采用乙腈-水體系,對于增加CsA在固定相上的吸附量是更有利的。雖然有機相的比例降低有利于改善分離和提高在固定相上的吸附量,但是會增加制備時間和導致峰展寬,所以有機相比例的選擇要兼顧分離度、吸附量、分離時間和峰展寬眾多因素。

用q/C對q作圖,在甲醇-水和乙腈-水體系下得到了近似的結果(見圖7)。q/C隨著q增加而遞減,意味著吸附等溫曲線的斜率逐漸減小,符合Langmuir型吸附行為,對應Langmuir峰形(即拖尾峰),與2.2節(jié)峰形考察結果一致。當流動相中樣品的質量濃度在0.01～0.03 g/L時,q/C的值隨著吸附量q的增加迅速下降,此時CsA的峰形會隨著上樣量的增加而拖尾。而在低有機相比例中(84%甲醇或75%乙腈),這種趨勢會減弱。

用吸附等溫線模型對以上數(shù)據(jù)進行擬合,在甲醇-水體系中,最佳模型為Langmuir模型[18],即

(2)

而在乙腈-水體系中,最佳模型為Moreau模型[19],即

(3)

其中q*為單層吸附飽和量,b為吸附位點的吸附平衡常數(shù),C為流動相中樣品的質量濃度,I為溶質間相互作用力。

此擬合結果說明,CsA在甲醇-水體系中,固定相與溶質之間為單層吸附,只有一類吸附位點起主要作用。隨著甲醇比例降低,單層飽和吸附量q*增大,而吸附平衡常數(shù)b減小,樣品之間的相互作用力可以忽略(見表1)。Moreau模型是Langmuir模型的一個簡單延伸,因此固定相與CsA之間仍為單層吸附,但是溶質之間的相互作用力是不能忽略的。推測這種差異主要是由于有機溶劑類型不同造成的。在甲醇-水體系中,甲醇是質子型溶劑,會對CsA分子之間的作用力,比如氫鍵作用產(chǎn)生一定的破壞作用,而乙腈是非質子型溶劑,對這種分子間作用力破壞能力弱,這也說明了乙腈濃度越高,溶質之間的分子作用力越強。如表1所示,隨著乙腈比例從85%降低至75%,飽和吸附量q*由123 g/L增加到197 g/L,而I由0.618降低到0.588。對比兩種體系下的參數(shù),在乙腈-水體系下,固定相對溶質有更大的吸附容量。

表 1 甲醇-水和乙腈-水中環(huán)孢素A的吸附模型參數(shù)Table 1 Adsorption model parameters for CsA in MeOH-H2O and ACN-H2O

2.4 環(huán)孢素A的純化制備探索

根據(jù)以上研究結果選擇CsA的分離體系。從CsA的保留來看,甲醇-水或者乙腈-水通過調(diào)整比例都可以獲得合適的保留,而且兩者在上樣量增加時,峰形變化是相似的。相對來講,乙腈的比例變化對保留影響不那么劇烈,有利于分離穩(wěn)定性的控制,而且在乙腈-水條件下,CsA在固定相上的吸附量更大。在乙腈-水條件下優(yōu)化了方法,使雜質有了更好的分離。實驗也考慮采用小濃度范圍的線性梯度的洗脫方式,一方面有利抑制峰展寬,而且也有利于保持分離的穩(wěn)定。綜上所述,嘗試采用0～60 min 65%～75%ACN, 60～80 min 75%ACN的條件對環(huán)孢素A進行分離(見圖8)。上樣量為15 mg,按照時間對色譜峰進行收集和純度分析,合并保留時間為28～42 min的餾分,可以將主峰的色譜純度由粗品的89%提高到99.8%,控制雜質含量小于0.2%,回收率為77.7%。此方法可以作為反相色譜模式下純化CsA的參考。

圖 8 環(huán)孢素A的制備分離色譜圖Fig. 8 Chromatogram of preparative-scale separation of CsA C18 column (150 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phase: 0-60 min, 65/35-75/25, 60-80 min, 75/25 (ACN-H2O); flow rate: 0.6 mL/min; column temperature: 55 ℃; detection wavelength: 203 nm; sample concentration: 500 g/L; injection volume: 30 μL.

3 結論

本文開展了反相色譜模式下CsA保留行為的研究工作,考察了影響CsA峰形的關鍵因素,通過測定吸附等溫線深入認識CsA在反相色譜中的吸附行為。研究結果為CsA進一步的制備純化提供了理論依據(jù)。和已有的正相色譜方法相比,本工作發(fā)展的高效反相色譜制備方法流動相條件簡單,在純化效率和自動化控制方面具有一定的優(yōu)勢。后續(xù)工作將充分考察本方法的實際工業(yè)應用價值。