楊麗霞, 黃小貝, 曾希珂, 易 姿

(1. 長沙市食品藥品檢驗所, 湖南 長沙 410036; 2. 國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心, 湖南 長沙 410036)

氯苯胺靈(chlorpropham,結(jié)構(gòu)式見圖1)既是植物生長調(diào)節(jié)劑又是除草劑,常用于馬鈴薯的采后處理,以抑制其發(fā)芽[1,2],也可用于果樹的疏花、疏果及防除一年生禾本科雜草和少數(shù)闊葉雜草[3]。按照我國農(nóng)藥規(guī)定,氯苯胺靈為低毒農(nóng)藥,但是氯苯胺靈在作物種植中的不當(dāng)或過量使用,會隨著食物鏈和水循環(huán)影響動物源食品安全以及人體健康[4,5]。因氯苯胺靈母體和代謝物3-氯苯胺靈具有嚴重的慢性風(fēng)險,對消費者、非靶標節(jié)肢動物存在潛在內(nèi)分泌干擾特性,歐盟委員會決定不再批準氯苯胺靈的使用[6]。目前,豬、牛、羊、雞、鴨等動物飼養(yǎng)周期短,易導(dǎo)致藥物在動物體內(nèi)代謝不完全,存在藥物殘留風(fēng)險。為降低食品安全風(fēng)險,建立一種動物源食品中氯苯胺靈殘留量的檢測方法,可為氯苯胺靈的風(fēng)險評估提供檢測技術(shù)依據(jù)。

圖 1 氯苯胺靈的分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Molecular structure of chlorpropham

根據(jù)GB 2763-2019《食品中農(nóng)藥殘留最大殘留量》[7],氯苯胺靈在牛肉中的限量值為0.1 mg/kg、牛內(nèi)臟和生乳限量值均為0.01 mg/kg,檢測方法為GB 19650-2006《動物肌肉中478種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定》[8]和GB/T 23210-2008《牛奶和奶粉中511種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定》[9];氯苯胺靈在馬鈴薯中的限量值為30 mg/kg,檢測方法為GB 23200.9-2016《糧谷中475種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定》[10]、GB 23200.113-2018《植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定》[11],采用的均為氣相色譜-質(zhì)譜法。文獻報道氯苯胺靈的檢測方法有反相高效液相色譜法[12]、氣相色譜法、液相色譜法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14]等。現(xiàn)有文獻大多針對植物源性樣品,對動物源性食品中氯苯胺靈的研究較少。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與氣相色譜-質(zhì)譜法相比,具有較高的靈敏度,抗干擾能力強,檢測時間更短,檢測效率更高,更加適用于大批量樣品的檢測。本文結(jié)合氯苯胺靈的物理和化學(xué)性質(zhì)、固相萃取的凈化優(yōu)勢和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏特性,優(yōu)化前處理過程和色譜-質(zhì)譜條件,開發(fā)出了一種固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(SPE-UHPLC-MS/MS)來測定不同動物源食品中氯苯胺靈殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500+型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB SCIEX公司), SF-16R型高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司), Direct-Q?8 UV-R型超純水機(美國Millipore公司), MV5全自動高通量平行濃縮儀(萊伯泰科有限公司), HES-24B真空固相萃取裝置(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司), KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), CM-1000型振蕩混勻器(日本EYELA公司), GM200刀式研磨儀(德國Retsch(萊馳)), ProElut PLS固相萃取柱(200 mg/6 mL)(上海迪柯馬分析技術(shù)有限公司)。

氯苯胺靈標準溶液(1 000 mg/L)購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心;甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純)購于德國Merck KGa A公司;正己烷(色譜純)購于美國Tedia公司;甲酸(色譜純)購于aladdin公司;無水硫酸鈉(AR純)和氯化鈉(AR純)購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司,0.22 μm聚四氟乙烯濾膜(PTFE)購自希波氏公司。

13種動物源食品(豬肉、牛奶、牛肉、雞肉、鴨肉、雞蛋、雞胗、鴨蛋、豬腰、豬肝、牛肝、羊肉、鴨胗)均購自當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液:準確吸取1 mL氯苯胺靈標準溶液(1 000 mg/L),用甲醇稀釋定容至25 mL,配制成40 mg/L的氯苯胺靈標準儲備液轉(zhuǎn)移至棕色玻璃瓶中,于0～4 ℃避光儲存。

標準工作液:準確吸取氯苯胺靈標準儲備液適量,用甲醇稀釋,配制成1.0 mg/L的標準工作液,于0～4 ℃避光儲存,備用。臨用時,用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋成適當(dāng)濃度,待測。

1.3 樣品制備

1.3.1樣品預(yù)處理

牛、羊、豬、鴨、雞等畜禽類樣品取可食肌肉組織、內(nèi)臟約300 g,切碎后經(jīng)刀式研磨儀充分攪碎混勻,裝入潔凈容器內(nèi),密封,于-18 ℃以下冷凍保存。牛奶樣品取300 g,混勻,裝入潔凈容器內(nèi),密封,于0～4 ℃冷藏保存。蛋類樣品取10枚,去殼后經(jīng)刀式研磨儀充分攪碎混勻,裝入潔凈容器內(nèi),密封,于0～4 ℃冷藏保存。

1.3.2樣品前處理

稱取均質(zhì)樣品3.0 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞塑料離心管中,靜置使其恢復(fù)至室溫;用移液管準確移取10 mL乙腈加入至樣品中,超聲5 min,均質(zhì)15 min;加入約2 g氯化鈉和約3 g無水硫酸鈉,均質(zhì)3 min; 10 000 r/min離心3 min;取上清液7.0 mL于10 mL塑料離心管中;加入用乙腈飽和過的正己烷2 mL,均質(zhì)2 min, 10 000 r/min離心2 min,去除正己烷層;準確移取5 mL提取液于帶刻度的具塞離心管中,45 ℃氮吹濃縮至約0.5 mL,用超純水定容至5 mL,待進一步凈化。

用5 mL甲醇和5 mL水活化ProElut PLS固相萃取柱,上樣,用5 mL 30%乙腈水溶液淋洗除雜后抽干小柱,用8 mL乙腈洗脫,洗脫液于45 ℃氮吹至約0.5 mL,用乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液(1∶1, v/v)定容至2 mL,過0.22 μm PTFE濾膜,待測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.5 mL/min;流動相:A為0.2%(v/v)甲酸-水溶液,B為乙腈。流動相梯度洗脫程序:0～1.00 min, 15%B; 1.00～5.00 min, 15%B～90%B; 5.00～8.00 min, 90%B; 8.00～8.01 min, 90%B～15%B; 8.01～10.0 min, 15%B。進樣體積:5 μL。

質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧電離(ESI)源;掃描方式:正離子掃描;離子源溫度(TEM): 550 ℃;霧化氣(Gas 1)壓力:379 kPa(55 psi);輔助氣(Gas 2)壓力:379 kPa(55 psi);離子噴霧電壓(IS):+5 500 V;氣簾氣(CUR)壓力:241 kPa(35 psi);檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。氯苯胺靈在正離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表 1 氯苯胺靈在正離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters for chlorpropham

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

氯苯胺靈為弱極性化合物,液相色譜方法常用的色譜柱為C18柱[15,16],本方法比較了3種規(guī)格的C18色譜柱的分離效果(見圖2)。本方法以豬肉樣品為研究對象,在流動相均采用0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈的梯度洗脫條件下,比較了Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(100 mm×2.1 mm, 5 μm)和Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)3種色譜柱對氯苯胺靈的保留能力和出峰效果。結(jié)果表明,100 mm柱與150 mm柱比較,保留時間出現(xiàn)前移,但峰形有明顯的拖尾;EclipsePlus C18柱與ZORBAX SB-C18相比,采用ZORBAX SB色譜柱時,氯苯胺靈的峰形更好,更對稱。因此,選用Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)作為氯苯胺靈的分離色譜柱。

圖 2 采用不同色譜柱時氯苯胺靈的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of chlorpropham on different columns

2.1.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實驗分別考察了氯苯胺靈在正負兩種質(zhì)譜電離模式條件下的響應(yīng)情況。取1.0 mg/L的氯苯胺靈工作液,分別用正離子模式和負離子模式進行條件優(yōu)化。結(jié)果表明,正離子模式的響應(yīng)要明顯優(yōu)于負離子模式。氯苯胺靈分子結(jié)構(gòu)中帶有-NH,可能容易加合氫離子形成帶正電荷的離子,提高離子化效率,故氯苯胺靈在正離子環(huán)境中響應(yīng)更高。

在針泵連續(xù)進樣方式下,采取Q1 Scan全掃描模式對目標物進行全掃,得到母離子(m/z213.9),采取Product Ion Scan(MS2)模式對子離子進行掃描,得到相對豐度較高的特征碎片離子:m/z172.0和m/z154.1。對特征離子對的儀器參數(shù)(去簇電壓和碰撞能)進一步優(yōu)化,得到最優(yōu)化的分析參數(shù)。

2.1.3流動相的選擇

在正離子模式下,考察了3種流動相體系:0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈流動相體系、0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈流動相體系和水與乙腈流動相體系(見圖3)。結(jié)果表明,采用甲酸水-乙腈流動相體系時,氯苯胺靈的響應(yīng)明顯高于水-乙腈流動相體系,并且隨著酸性的提高,響應(yīng)更好,峰形更對稱且尖銳。因此,實驗選擇0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈作流動相。

圖 3 采用不同流動相時氯苯胺靈的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of chlorpropham obtained with different mobile phases

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

氯苯胺靈難溶于水,易溶于甲醇、乙腈等有機溶劑,對植物基質(zhì)進行分析時常用正己烷、乙腈等有機溶劑進行提取[11,17]?？紤]到本方法檢測對象為動物源食品,其成分較為復(fù)雜,蛋白和油脂含量都比較高,故使用肉類提取常用溶劑乙腈進行提取,并使用正己烷對提取液進行除油處理。

2.2.2固相萃取柱的選擇

各種SPE柱對樣品的凈化效果不同,本研究比較了陽離子交換SPE柱ProElut PXC(60 mg/3 mL)、陰離子交換SPE柱ProElut PXA(60 mg/3 mL)、硅酸鎂SPE柱ProElut Florisil(200 mg/3 mL)、親水親脂平衡SPE柱ProElut PLS(200 mg/6 mL)4種SPE柱對氯苯胺靈的柱保留量。采用5 mL 0.1 mg/L的氯苯胺靈標準溶液過柱,測定流出液中氯苯胺靈的含量,計算4種SPE柱的柱保留量,其柱保留量百分比分別為:PLS 98.3%、PXA 85.3%、PXC 88.7%和Florisil 60.2%。結(jié)果表明,PLS SPE柱的保留能力較強,可提高方法的最終回收效率。

2.2.3淋洗液和洗脫液的選擇

淋洗液:以體積比為0∶100、10∶90、20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0的乙腈-水溶液作為淋洗液,收集濾液,采用優(yōu)化好的色譜-質(zhì)譜條件測定。結(jié)果顯示:當(dāng)淋洗液乙腈-水溶液有機相比例達到≥40%時,濾液中可檢出氯苯胺靈,且含量隨著有機相比例升高而增大(見圖4)。為有效去除蛋白、油脂等雜質(zhì),又能獲得更好的回收率,本實驗選用乙腈-水溶液(30∶70, v/v)作為固相萃取淋洗液。

圖 4 不同體積比例的乙腈-水溶液對氯苯胺靈的淋洗能力(n=3)Fig. 4 Washing capacity of acetonitrile-water solution with different volume ratios on the recovery of chlorpropham (n=3)

洗脫液:比較了100%甲醇、100%乙腈、1%甲酸-甲醇、90%甲基叔丁基醚-乙腈、5%氨水-甲醇、100%乙酸乙酯、90%乙酸乙酯-甲醇7種常用洗脫溶劑對氯苯胺靈在ProElut PLS SPE柱上的洗脫能力。同時用以上7種溶劑配制標準溶液。洗脫能力采用洗脫后測定的峰面積(AX)與配制的標準溶液峰面積(A0)之比評價(洗脫能力=AX/A0×100%),結(jié)果依次為97.8%、98.5%、95.5%、89.3%、87.1%、68.3%、69.5%,表明用100%甲醇、100%乙腈、1%甲酸-甲醇3種溶液洗脫效果較好,考慮到樣品提取使用的是乙腈,本實驗選用乙腈作為流動相洗脫液。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)評價

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物以外的組分在分析過程中對目標物有顯著的干擾,從而影響分析結(jié)果的準確性。本實驗繪制基質(zhì)匹配標準溶液曲線和溶劑標準溶液曲線,通過兩個標準曲線斜率的比值對基質(zhì)效應(yīng)進行評估[18]。基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配標準溶液曲線斜率/溶劑標準溶液曲線斜率×100%。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)值在85%～115%之間時,說明無明顯基質(zhì)效應(yīng)。

本工作用豬肉、牛奶、牛肉、雞肉、鴨肉、雞蛋、雞胗等空白樣品基質(zhì)提取液和溶劑溶液(乙腈-0.2%(v/v)甲酸水溶液(1∶1, v/v))分別配制成0.5、1.0、2.25、4.5、9.0、45.0、100.0 μg/L系列標準溶液,按照優(yōu)化好的色譜-質(zhì)譜條件進行分析,對氯苯胺靈的峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x, μg/L)進行線性回歸,繪制標準曲線,計算基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果表明:13種樣品的基質(zhì)效應(yīng)值在90.9%～106.6%之間(見表2),基質(zhì)增強或減弱效應(yīng)不明顯,但由于各基質(zhì)成分復(fù)雜且存在一定差異性,為了檢測的準確性,所有樣品檢測均用空白基質(zhì)匹配溶液配制標準溶液進行樣品檢測。

表 2 不同基質(zhì)中氯苯胺靈的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r2), and matrix effects (ME) of chlorpropham in different matrices

表 3 不同基質(zhì)中氯苯胺靈的加標回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precision of chlorpropham in different matrices (n=6)

2.4 線性范圍和定量限

表2數(shù)據(jù)同時表明,豬肉、牛奶、牛肉、雞肉、鴨肉、雞蛋、雞胗、鴨蛋、豬腰、豬肝、牛肝、羊肉、鴨胗13種樣品基質(zhì)中氯苯胺靈在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好,其線性相關(guān)系數(shù)均不低于0.992 9。本實驗根據(jù)所測基質(zhì)樣品溶液信噪比(S/N)≥10計算得到該方法檢測氯苯胺靈的定量限(LOQ)為0.003 mg/kg,與文獻報道和國標方法相比具有更高的靈敏度:文獻[17]的方法定量限為0.006 7 mg/kg,GB 19650-2006[8]的方法定量限為0.083 mg/kg,GB/T 23210-2008[9]的方法定量限為0.028 mg/kg(牛奶基質(zhì))和0.139 mg/kg(奶粉基質(zhì))。

2.5 準確度和精密度

通過對空白樣品進行加標回收,考察本方法的準確度與精密度。按照優(yōu)化后的提取和凈化步驟,在上述13種基質(zhì)樣品中分別添加0.003、0.006、0.060 mg/kg 3個水平的氯苯胺靈標準溶液進行加標試驗,每個加標水平做6個平行(見表3),不同基質(zhì)加標水平為3 μg/kg時的色譜圖見圖5。結(jié)果顯示,在低、中、高3個加標水平下,不同基質(zhì)樣品中氯苯胺靈的平均回收率為74.9%～97.6%,相對標準偏差為2.9%～9.5%,符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》[19]規(guī)定的要求,可用于動物源食品中氯苯胺靈的定量檢測。

圖 5 不同基質(zhì)溶液加標樣品中氯苯胺靈(3 μg/kg)的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of chlorpropham (3 μg/kg) spiked in different matrices

2.6 實際樣品的測定

利用本方法對市售的上述13種動物源食品共計60批次樣品進行氯苯胺靈殘留量檢測,均未檢出氯苯胺靈。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化色譜-質(zhì)譜條件,采用乙腈提取,選擇ProElut PLS SPE柱,優(yōu)化 SPE淋洗液、洗脫液成分,以空白基質(zhì)匹配溶液配制標準曲線,建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中氯苯胺靈殘留的檢測方法。該方法前處理簡便易行,基質(zhì)干擾小,靈敏度高,線性關(guān)系、準確度和精密度滿足方法學(xué)要求,適用于多種動物源食品中氯苯胺靈的定性和定量檢測。