周梅月 全卉 陳賀寧 江宇泳

酒精性肝病(ALD)是全球肝病的主要類型,中國(guó)ALD的發(fā)病率也正在迅速增加[1-2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明腸-肝軸機(jī)制是導(dǎo)致ALD的重要機(jī)制之一[3]。其以腸道通透性增加為形式的腸屏障功能障礙促進(jìn)內(nèi)毒素進(jìn)入肝臟，觸發(fā)了肝臟炎癥的促炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4-6]。此外，臨床研究表明酒精依賴性受試者的腸道通透性增加主要局限于小腸，并且長(zhǎng)期飲酒會(huì)導(dǎo)致血液中內(nèi)毒素水平升高[7-8]。這些研究都證明了ALD的發(fā)生與腸屏障功能損傷、內(nèi)毒素水平升高關(guān)系密切。本文通過(guò)微調(diào)Gao-Binge ALD小鼠模型，檢測(cè)ALD模型小鼠血漿ALT、AST、內(nèi)毒素水平，觀察肝臟、小腸病理改變等，驗(yàn)證Gao-Binge ALD模型小鼠的損傷特點(diǎn)，為ALD模型的選擇提供借鑒，并為“從腸治肝”的研究提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只C57BL/6N雄性小鼠，SPF級(jí)，(20±2) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006；合格證號(hào)：110011200107412545；飼養(yǎng)地：北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

二、主要試劑

Lieber-DeCarli對(duì)照液體飲食、Lieber-DeCarli酒精液體飲食、麥芽糖糊精均購(gòu)自Bio-Serv公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自北京化工廠；AST、ALT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自富士膠片和光純耀化學(xué)有限公司；內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；Occludin抗體、Zo-1抗體購(gòu)自ABCAM公司；HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP-山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自Jackson公司; BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Cwbiotech公司；彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自碧云天生物公司。

三、主要檢測(cè)儀器

全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)，正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)，成像系統(tǒng)(日本尼康)，動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀(湛江安度斯生物有限公司)。

四、動(dòng)物分組與模型建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將小鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，每組10只。ALD小鼠模型的制備：參考文獻(xiàn)[9]并根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整制備ALD模型的喂食量以保證不同組別小鼠飲食熱量相同(表1)：模型組小鼠首先使用Lieber-DeCarli對(duì)照液體飲食喂養(yǎng)5 d，然后使用含酒精的Lieber-DeCarli液體飲食喂養(yǎng)10 d，第16天清晨對(duì)模型組小鼠進(jìn)行一次大劑量酒精(5 g/kg)灌胃。正常組小鼠造模期間給予對(duì)照液體飲食，并且保證與模型組小鼠等熱量喂養(yǎng)。第16天清晨對(duì)正常組小鼠進(jìn)行一次大劑量麥芽糖糊精(9 g/kg)灌胃。灌胃9 h后，眼球取血，頸椎脫位處死小鼠，并保留肝臟、小腸和外周血標(biāo)本。

表1 造模方法

五、測(cè)定指標(biāo)及方法

(一)肝臟指數(shù)與組織病理學(xué)檢查 每日稱量小鼠體質(zhì)量，取材時(shí)，分離完整新鮮肝臟后稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)=肝臟濕重/體質(zhì)量×100%。4%多聚甲醛固定肝組織和小腸組織后，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟和小腸病理變化。

(二)血漿生化指標(biāo)檢測(cè) 小鼠眼球取血后，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min后，分離得到血漿，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血漿中AST、ALT活性，使用動(dòng)態(tài)試管檢測(cè)儀通過(guò)光度測(cè)定法檢測(cè)血漿內(nèi)毒素水平。

(三)Western Blot 檢測(cè) 小腸組織勻漿后，12 000 g離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白定量。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別在4 ℃冰箱孵育Zo-1、Occludin、β-actin一抗過(guò)夜。次日洗膜，二抗室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影，拍照。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組計(jì)量資料均符合正態(tài)時(shí)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，若有一組計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠一般情況及血生化指標(biāo)比較

模型組小鼠與正常組小鼠造模前初始體質(zhì)量和造模后最終體質(zhì)量，兩組比較均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，保證了造模過(guò)程中兩組小鼠等熱量喂養(yǎng)。模型組小鼠的肝臟指數(shù)較正常組小鼠肝臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)。與正常組相比，模型組小鼠血漿ALT、AST、內(nèi)毒素水平均顯著增高(P均<0.01)(表2)。

表2 小鼠一般情況、血生化指標(biāo)比較

二、小鼠肝臟和小腸組織病理檢查

肝臟組織HE染色結(jié)果顯示：正常組小鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)較豐富，嗜酸性染色，細(xì)胞核圓并且清晰，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列整齊，無(wú)明顯病變。模型組小鼠肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞界限模糊不清，大量肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大而融合脂滴，將核擠向一側(cè)類似脂肪細(xì)胞，部分肝細(xì)胞核發(fā)生混濁腫脹，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

小腸組織HE染色結(jié)果顯示：正常組小鼠小腸的腺體排列整齊，上皮完整，黏膜正常，無(wú)明顯病變。模型組小鼠小腸組織形態(tài)紊亂，部分腺體壞死脫落，甚至斷裂，絨毛破損，上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞丟失減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸內(nèi)血管擴(kuò)張充血(圖1)。

A：正常小鼠肝臟病理，×20；B：模型小鼠肝臟病理，×20；C：正常小鼠小腸病理，×20；D：模型小鼠小腸病理，×20

三、Western Blot 檢測(cè)小腸組織緊密連接蛋白Zo-1和Occludin的表達(dá)情況

與正常組相比，模型組小鼠緊密連接蛋白Zo-1(P<0.05)和Occludin(P<0.01)的表達(dá)水平顯著降低(圖2)。

1、2分別為正常組、模型組

討 論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究可以提供一種更好的了解ALD發(fā)病機(jī)制的方法。但是，許多ALD動(dòng)物模型之間差異較大，并非所有模型都能完全模擬人類ALD[10]。值得重視的是，在長(zhǎng)期過(guò)量飲酒的人群中，約95%會(huì)出現(xiàn)肝臟脂肪變性，35%可逐漸發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化甚至肝癌[11]。因此，建立和區(qū)分ALD不同階段的動(dòng)物模型對(duì)研究的準(zhǔn)確性十分重要。

本研究通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，需調(diào)整小鼠喂食量以保證不同組別小鼠飲食熱量相同。其中，模型組與正常組小鼠初始體質(zhì)量和最終體質(zhì)量均沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明造模過(guò)程中保證了兩組小鼠之間等熱量攝入，避免了因飲食攝入量不同造成的差異。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血生化指標(biāo)AST、ALT顯著升高，肝臟病理出現(xiàn)大量脂肪變和存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。這表明Gao-Binge ALD模型與人類酒精性肝炎較為相似，為Gao-Binge ALD模型用于酒精性肝炎的研究使用提供了理論依據(jù)。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠血液中內(nèi)毒素水平顯著升高，小腸HE染色出現(xiàn)組織形態(tài)紊亂，絨毛破損，上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞丟失減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，小腸組織中緊密連接蛋白Zo-1和Occludin的表達(dá)顯著降低。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了Gao-Binge ALD模型時(shí)小鼠肝臟發(fā)生損傷，同時(shí)腸道屏障功能被破壞，內(nèi)毒素水平升高，驗(yàn)證了ALD的“腸-肝軸”理論[12-13]。尤其是小腸HE染色顯示杯狀細(xì)胞減少?gòu)牟±斫嵌闰?yàn)證了前人的研究成果：腸上皮中的杯狀細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性三葉因子和黏蛋白，對(duì)腸道屏障功能有保護(hù)作用[14]。另外很重要的是，構(gòu)建Gao-Binge ALD模型時(shí)可通過(guò)添加輔劑模擬其他危險(xiǎn)因素合并酒精性肝損傷，為探索ALD的危險(xiǎn)因素或探究其他疾病與ALD之間的共同作用提供了很大便利[15]。

綜上，腸道來(lái)源的內(nèi)毒素等有害物質(zhì)誘發(fā)肝臟炎癥在ALD的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，但ALD治療仍然是臨床難點(diǎn)。選擇合適的動(dòng)物模型探討ALD的發(fā)病機(jī)制和有效治療方法意義重大。本研究觀察了Gao-Binge ALD模型小鼠的腸道、肝臟組織損傷，血漿內(nèi)毒素水平升高，為從“腸-肝軸”研究ALD動(dòng)物模型的選擇提供了理論支持，也為從腸治肝，提供了理論依據(jù)。然而Gao-Binge ALD模型亦存在一定的局限性，不能造成小鼠酒精性肝硬化的發(fā)生，對(duì)于酒精性肝硬化的研究，應(yīng)另選其他經(jīng)典模型。