王夢真

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系,山東 青島 266071)

阿爾茲海默病(AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其記憶障礙與神經(jīng)元變性以及突觸損傷有關(guān)[1-2]。神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)是公認(rèn)的認(rèn)知和神經(jīng)退行性疾病中藥物開發(fā)的靶標(biāo)[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，nAChR以同聚或異聚形式存在，其中含量最豐富的同聚nAChR是α7-nAChR，α7-nAChR是大腦(尤其是海馬)中主要的nAChR亞型之一[4-5]。

α7-nAChR屬于五聚體配體門控離子通道超家族，它通過打開可滲透陽離子的內(nèi)在通道對(duì)乙酰膽堿(Ach)做出應(yīng)答，從而觸發(fā)膜快速除極和鈣離子內(nèi)流[2]。有研究表明，α7-nAChR與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[6]，并且β-淀粉樣蛋白(Aβ)對(duì)α7-nAChR有極高親和力，且影響α7-nAChR的功能[7-10]。在AD病人和動(dòng)物模型中，α7-nAChR的表達(dá)水平明顯升高[11-13]。另有研究結(jié)果表明，nAChR的α7亞基基因缺失可改善AD模型小鼠的功能缺陷[14]，這提示α7-nAChR表達(dá)上調(diào)可能參與了AD的發(fā)病[15]。眾所周知，α7-nAChR具有較高的Ca2+滲透性[16]，并且α7-nAChR的激活可以增加突觸前谷氨酸的釋放[17]，這兩者都可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)毒性。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是探討在低濃度膽堿(choline)存在的條件下，α7-nAChR正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(PAM)NS1738(Ⅰ型PAM)和PNU120596(Ⅱ型PAM)對(duì)海馬神經(jīng)元活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DMEM高糖及DMEM/F12培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)，青霉素/鏈霉素雙抗溶液(中國索萊寶科技有限公司)，2.5 g/L胰蛋白酶(以色列BI公司)，B27無血清添加劑(美國Gibco公司)，D-多聚賴氨酸(美國Sigma公司)，Choline、PNU120596及NS1738(中國MCE公司)，Bax抗體(中國Cell Signaling Technology公司)，Bcl-2抗體(中國Absin公司)，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀。

1.2 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)前高壓處理實(shí)驗(yàn)所用器械，烘干箱烘干；細(xì)胞培養(yǎng)板用D-多聚賴氨酸提前3 h鋪板，用高壓滅菌雙蒸水清洗3次備用。將新生24 h以內(nèi)SD乳鼠斷頭取腦，置DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，取出海馬組織，去除腦膜和血管膜，37 ℃下用胰蛋白酶消化5 min，加入終止液終止消化。用不同量程的槍頭輕輕梯度吹打，將組織吹打成單細(xì)胞懸液，每吹打完1次取上清于離心管中，吹打結(jié)束后以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含有體積分?jǐn)?shù)0.02 B27無血清添加劑、體積分?jǐn)?shù)0.01青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液配制的培養(yǎng)液重懸，以2×108/L的細(xì)胞密度接種于12孔板中，每3.5 d換液1次，培養(yǎng)細(xì)胞至7 d左右，觀察細(xì)胞狀態(tài)以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)全程在冰上操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

將海馬神經(jīng)元細(xì)胞分為對(duì)照組(A組,不進(jìn)行任何處理)、choline組(B組)、choline+NS1738組(C組)和choline+PNU120596組(D組)。Choline、NS1738和PNU120596的藥物處理濃度分別為1、5、1 μmol/L。將細(xì)胞置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h重新更換培養(yǎng)液并加藥處理，共處理7 d。

1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

在12孔板中加入50 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮板將培養(yǎng)板底的細(xì)胞刮下，用移液器將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，4 ℃下以12 000 r/min離心30 min。用移液器吸取40 μL上清至另一EP管中，使用BCA試劑盒檢測上清液中蛋白質(zhì)濃度，加入5×Loading Buffer，95 ℃以上加熱5 min。按照BCA試劑盒檢測的蛋白濃度計(jì)算SDS-PAGE凝膠電泳的上樣量，電泳電壓80 V，跑進(jìn)分離膠后，將電壓調(diào)至120 V。電泳之后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，300 mA濕轉(zhuǎn)90 min，切下所需分子量的條帶，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，分別加入用TBST稀釋的Bax抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶10 000)孵育相應(yīng)的條帶，4 ℃搖床過夜。以TBST洗條帶3次，每次10 min，加入HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(稀釋比例1∶10 000)室溫孵育1 h，孵育完成后以TBST洗3次，每次10 min。用ECL發(fā)光液避光孵育1 min顯影。應(yīng)用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)含量。

1.5 海馬神經(jīng)元LDH分泌量檢測

細(xì)胞處理結(jié)束后，各組取部分培養(yǎng)液，置于冰上以備LDH檢測。LDH檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將待測樣本轉(zhuǎn)移到96孔板中，加入基質(zhì)緩沖液和輔酶Ⅰ，37 ℃孵育15 min，加入2,4-二硝基苯肼，37 ℃孵育15 min，加入NaOH溶液，室溫孵育5 min，用酶標(biāo)儀測定各孔在波長450 nm處的吸光度值。按照試劑盒說明書的公式計(jì)算培養(yǎng)液中LDH含量。

1.6 線粒體膜電位(△Ψm)檢測

細(xì)胞處理結(jié)束后棄上清液，用0.01 mol/L的HBS清洗1次，每孔加入5 mg/L的羅丹明123(Rh123)溶液500 μL，37 ℃避光孵育30 min，吸除Rh123，使用HBS清洗3次，每孔加入新的HBS 500 μL，吹打成單細(xì)胞懸液，用300目細(xì)胞篩過濾到流式管中，以激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長523 nm進(jìn)行測定，F(xiàn)CS/SSC設(shè)門，收集門內(nèi)10 000個(gè)細(xì)胞，用CELLQuest Pro分析系統(tǒng)分析每組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NS1738和PNU120596對(duì)原代海馬神經(jīng)元Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，choline組、choline+NS1738組、choline+PNU120596組Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值均明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.15，q=4.742～7.742，P<0.05)；與choline組相比較，choline+NS1738組、choline+PNU120596組Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值差異無顯著意義(q=3.000、2.240，P>0.05)。見表1。

2.2 NS1738和PNU120596對(duì)原代海馬神經(jīng)元LDH分泌的影響

與對(duì)照組相比，choline組、choline+NS1738組、choline+PNU120596組LDH分泌明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.72，q=4.975～7.807，P<0.05)；與choline組相比，choline+NS1738組、choline+PNU120596組LDH分泌差異無顯著性(q=1.576、2.832，P>0.05)。見表1。

2.3 NS1738和PNU120596對(duì)原代海馬神經(jīng)元△Ψm的影響

與對(duì)照組相比，choline+NS1738組、choline+PNU120596組△Ψm明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.73，q=7.835、4.331，P<0.05)；與choline組細(xì)胞相相比，choline+NS1738組、choline+PNU120596組△Ψm也明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=10.550、7.045，P<0.05)；choline組△Ψm與對(duì)照組相比差異無顯著性(q=2.714，P>0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)元Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值、LDH分泌和△Ψm的比較

3 討 論

AD的一個(gè)標(biāo)志是Aβ沉積，這被認(rèn)為是淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)加工異常和Aβ產(chǎn)生增加的結(jié)果[18]。α7-nAChR屬于五聚體配體門控離子通道超家族，它通過打開可滲透陽離子的內(nèi)在通道對(duì)Ach做出應(yīng)答，從而觸發(fā)膜快速除極和鈣離子內(nèi)流[2]。有證據(jù)表明，α7-nAChR與AD相關(guān)，參與認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶、獎(jiǎng)賞等過程[19]，在AD病人大腦(尤其是海馬)中α7-nAChR表達(dá)明顯減少[20]，并且表達(dá)α7-nAChR的神經(jīng)元更容易出現(xiàn)AD神經(jīng)病理學(xué)特征[21]。受體激動(dòng)劑的應(yīng)用可能引起受體活化，但也會(huì)使其脫敏，可能無助于甚至是阻礙了受體對(duì)生理神經(jīng)元活性的反應(yīng)[22]。α7-nAChR的PAM是一類化合物，分為兩種類型：Ⅰ型(例如NS1738)主要增強(qiáng)激動(dòng)劑誘發(fā)的峰值電流，但可保持其快速動(dòng)力學(xué)特征，并且不會(huì)重新激活脫敏受體；Ⅱ型(例如PNU120596)可以延遲脫敏受體，并可重新激活脫敏受體[22]。PAM需要內(nèi)源性配體(即Ach或choline)來引發(fā)nAChR反應(yīng)[19]。PAM通過結(jié)合激動(dòng)劑或抑制劑的正構(gòu)位點(diǎn)來調(diào)節(jié)受體的功能，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信息傳遞。PAM的存在可以維持生理活動(dòng)時(shí)空模式，并增強(qiáng)響應(yīng)，所以與激動(dòng)劑相比，PAM具有內(nèi)源性激活特性，對(duì)受體更具選擇性，因此是更有前途的治療策略[23]。

但是，目前還不清楚α7-nAChR的下調(diào)或上調(diào)是否與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，choline組Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值下降，在存在1 μmol/L choline的條件下，應(yīng)用α7-nAChR PAM NS1738和PNU120596后，海馬神經(jīng)元Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值也明顯下降。Bax和Bcl-2屬于細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)蛋白，在正常生理?xiàng)l件下，Bax家族可促進(jìn)凋亡發(fā)生，而Bcl-2家族抑制凋亡發(fā)生，所以當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Bax/Bcl-2比值上升。該比值變小表明，使用α7-nAChR的PAM處理時(shí)，海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量減少。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生破裂，細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致培養(yǎng)液中的LDH含量增加。本文研究結(jié)果顯示，choline組、choline+NS1738組和choline+PNU120596組的LDH分泌減少，也印證了海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量減少。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡時(shí)，△Ψm減小甚至消失。而本文結(jié)果顯示，choline+NS1738組和choline+PNU120596組的△Ψm升高。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上表明，在choline濃度較低的條件下，應(yīng)用兩種PAM并未導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)，也從側(cè)面反映出了兩種藥物可提高海馬神經(jīng)元活性。但是與choline組相比，PAM處理組的Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值和LDH釋放差異均無顯著性，而△Ψm明顯升高。這表明在choline濃度較低的情況下，兩種PAM只引起了能量代謝方面的變化，細(xì)胞外的蛋白水平還未出現(xiàn)明顯變化，后續(xù)或許應(yīng)該提高choline和PAM的濃度進(jìn)一步研究。