宋立成，閆鵬，楊慶云，張晗，解立新，磨國鑫

中國人民解放軍總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學部，北京 100048

膿毒癥時，感染失控一方面是由于免疫細胞的失能和凋亡使機體對微生物的拮抗作用顯著減弱，同時,機體合并了多器官功能的異常，使得免疫系統(tǒng)和微生態(tài)之間的相互作用變的更加復雜。因此，在非危重癥或健康狀態(tài)下，誘導免疫抑制將會如何影響機體的微生態(tài)，可能會更好地反映免疫系統(tǒng)與肺部及腸道微生態(tài)之間的相互作用。

本研究通過建立免疫抑制小鼠模型，觀察小鼠腸道及肺部微生態(tài)的變化情況，確定健康狀態(tài)下免疫抑制對微生態(tài)的影響；同時觀察免疫正常及免疫抑制小鼠在膿毒癥早期腸道及肺部微生態(tài)的變化特點。

1 材料與方法

1.1 免疫抑制小鼠模型的建立 2021年1月4日至4月9日將64只4周齡的雄性C57BL6小鼠用隨機數(shù)字表法分為兩組，分別為：免疫正常組(control組，n=32)和免疫抑制組(MP-control,n=32)。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于無病原體的解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心動物實驗中心，接受12 h光照/12 h黑暗環(huán)境，給予充分的無菌水及鼠糧。在飼養(yǎng)2周后，分別給予control組小鼠每天200 μL 0.9%氯化鈉注射溶液連續(xù)腹腔注射30 d；MP-control組小鼠每天200 μL 0.9%氯化鈉注射溶液+甲潑尼龍(MP)(200 mg/kg)連續(xù)腹腔注射30 d。根據(jù)每日體質量變化及通過流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群進行模型評估。

1.2 膿毒癥模型的建立 對control組和MP-control組通過氣管內注入脂多糖(LPS)及腹腔聯(lián)合注射LPS建立膿毒癥小鼠模型。將LPS溶解于PBS中，配備為1 000 μg/mL，雄性小鼠通過吸入異氟烷進行麻醉，經(jīng)口插入氣管插管，LPS-control和MP-LPS組注入LPS溶液50 μL，同時兩組小鼠均腹腔注射LPS 溶液50 μL。其中control組和MP-control組均包含LPS-control組16只和MP-LPS組16只。

1.3 小鼠血液標本的提取及處理 在術后24 h，分別對control組小鼠(8只)、MP-control組小鼠(8只)、LPS-control組小鼠(8只)、MP-LPS組小鼠(8只)進行眼球取血，0.8～1 mL/只。取300 μL標本進行離心，在4 ℃條件下，轉速為1 000 r/min，離心15 min，離心結束后，小心吸取上層血清入1 mL抗凝管中，統(tǒng)一編號標記，置于-80 ℃儲存?zhèn)溆?。?00 μL標本，加入熒光標記的單克隆抗體，混勻后在室溫孵育20～30 min，加入2mL的1×RBC Lysis Buffer進行溶血處理，搖勻后在暗盒中孵育10 min后1500 r/min離心5 min，吸棄上清，加入2 mL的1×PBS輕柔吹洗、混勻，再離心(1 500 r/min，5 min)棄上清后重復，通過流式細胞儀檢測并記錄T淋巴細胞亞群的百分比。

1.4 16S rRNA檢測方法 在無菌操作下將右下肺分離，迅速放置于無菌凍存管中。將小鼠腹腔打開后，沿盲腸位置找到結腸，剪開切口，迅速將糞便標本置于專用糞便標本盒內。將上述樣品封裝、貼上標簽后置于液氮罐中，并轉移至-80 ℃的冰箱內凍存。將標本送至上海微基生物科技有限公司檢測，進行高通量16S rRNA基因測序技術分析。

2 結果

2.1 免疫抑制模型建立的評價 通過腹腔注入MP造成免疫抑制模型，發(fā)現(xiàn)MP-control組體質量先是逐步增加，第4天起顯著高于control組，此后體質量呈現(xiàn)逐步降低趨勢，第14天起體質量開始顯著低于control組，并持續(xù)至第30天(圖1)。建模完畢后，MP-control組淋巴細胞計數(shù)顯著降低(表1)，同時伴有CD3+CD8+比例的顯著升高(表1)，及CD4+/CD8+的顯著降低(表1)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，MP干預后CD4+CD44high及CD8+CD44highT細胞的比例均顯著升高(表1)，提示幼稚型T細胞數(shù)量及比例的顯著降低，T淋巴細胞的激活程度和成熟度顯著升高，凋亡風險也愈加升高。

表1 兩組免疫抑制模型T淋巴細胞亞群構成比的變化

圖1 免疫抑制模型建立后各組體質量的變化

2.2 免疫正常組和免疫抑制組經(jīng)LPS干預后疾病嚴重程度特點 與control相比，MP預先干預并不會對促炎因子或適應性免疫相關因子產(chǎn)生影響，而LPS刺激后，免疫正常組的腫瘤壞死因子α(TNF-α),干擾素γ(IFN-γ),白細胞介素10(IL-10)和白細胞介素17A(IL-17A)均顯著升高，而MP-control組經(jīng)LPS刺激后免疫系統(tǒng)各因子與control相比均無明顯改變(表2)。生存曲線顯示，MP-control組給予LPS刺激后48h生存率顯著降低，與LPS組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：**P<0.01。

表2 膿毒癥對免疫抑制及免疫正常組外周血炎癥因子的影響

2.3 肺組織及糞便內α多樣性的比較 與control組相比，MP-control組肺組織shannon多樣性及simpson多樣性等均無明顯改變，LPS刺激后24 h，control組和MP-control組α多樣性均無統(tǒng)計學差異。而糞便中，MP-control組較control組shannon多樣性顯著升高，而LPS刺激后，MP-LPS組較LPS-control組shannon多樣性顯著降低，提示免疫抑制狀態(tài)下腸道微生態(tài)的脆弱性(表3)。

表3 肺組織及糞便α多樣性指數(shù)表

2.4 肺組織及糞便內各物種水平分布特點 肺組織分析發(fā)現(xiàn)，與control組相比，MP-control組變形菌門的水平顯著降低(圖3A)，以促炎反應相關的β-變形菌綱及其下的伯克霍爾德氏菌目及其下的從毛單胞菌科為主要降低菌種[1](圖3B、C、D)；厚壁菌門水平顯著升高(圖3A)，以產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFA)梭菌目、毛螺菌科升高最顯著(圖3C、D)，同時抗炎反應相關的厚壁菌門的芽孢桿菌綱、乳酸桿菌目、屬的水平也顯著升高[1](圖3B、C、E)。而擬桿菌門的各級微生物在MP-control組的肺內沒有顯著的變化。

糞便分析發(fā)現(xiàn)：MP-control組糞便中變形菌門的水平顯著升高(圖3F)，特別是以β-變形菌綱及其下的伯克霍爾德氏菌目及其下的從毛單胞菌科(圖3G、H、I)，和ε-變形菌綱及其下的彎曲菌目、螺桿菌科、屬為主要升高菌種(提示腸道內促炎反應的菌種增加)(圖3G、H、I、J)；厚壁菌門中的梭菌目、毛螺菌科升高顯著，與肺組織內變化趨勢相同，但芽孢桿菌綱、乳酸桿菌目、屬的水平顯著降低(圖3G、H、I、J)。與control組相比，糞便中擬桿菌門、綱、目顯著降低(這也是菌群紊亂的特征表現(xiàn))(圖3F、G、H)。

圖3 肺組織及糞便內各物種水平的相對豐度比較：A為門水平各組小鼠肺部微生態(tài)平均豐度比較；B為綱水平各組小鼠肺部微生態(tài)平均豐度比較；C為目水平各組小鼠肺部微生態(tài)平均豐度比較；D為科水平各組小鼠肺部微生態(tài)平均豐度比較；E為屬水平各組小鼠肺部微生態(tài)平均豐度比較；F為門水平各組小鼠糞便微生態(tài)平均豐度比較；G為綱水平各組小鼠糞便微生態(tài)平均豐度比較；H為目水平各組小鼠糞便微生態(tài)平均豐度比較；I為科水平各組小鼠糞便微生態(tài)平均豐度比較；J為屬水平各組小鼠糞便微生態(tài)平均豐度比較

上述分析提示免疫抑制小鼠肺及糞便中的微生態(tài)均發(fā)生了顯著改變，而且糞便和肺組織內變化的主要菌種變化特點存在差異。

與control組相比，膿毒癥發(fā)生后，免疫正常的LPS-control組肺內微生態(tài)僅有厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、毛螺菌科較control顯著升高(圖3A、B、C、D)，同時變形菌門、β-變形菌綱伯克氏菌目、從毛單胞菌科水平顯著降低(圖3A、B、C、D)；其余菌種水平?jīng)]有明顯改變；但LPS-control組糞便內微生態(tài)除了厚壁菌門、梭菌綱、梭菌目、毛螺菌科與肺內變化趨勢一致外，還伴有變形菌門β-、γ-、ε-各綱菌群的紊亂(圖3F、G)；同時厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目、科、屬的水平均顯著降低(圖3F、G、H、I、J)，提示膿毒癥早期，腸道內微生態(tài)發(fā)生顯著的變化，而肺部微生態(tài)在一定程度上受腸道微生態(tài)的影響。

與LPS-control的肺組織相比，MP-LPS組內厚壁菌門下的芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科的水平降低(圖3A、B、C、D)，提示炎癥更嚴重，而其他菌種的變化與LPS-control組變化趨勢相同。但在腸道中，MP-LPS的微生態(tài)較LPS-control組發(fā)生顯著性差異。表現(xiàn)在變形菌門及其下的各綱、目、科、屬的更顯著紊亂(圖3F、G、H、I、J)，特別是γ-變形菌綱的腸桿菌目、科、屬，和ε-變形菌綱的彎曲菌目、螺桿菌科、屬顯著升高，變形菌門下的各綱是肺部促炎環(huán)境及感染風險增加的重要標志物[2]。同時擬桿菌門、綱、目的降低趨勢與MP-control組相同，提示免疫抑制對擬桿菌的顯著影響(擬桿菌水平的穩(wěn)定是維持腸道菌群穩(wěn)定的重要因素，在一定程度上是促進腸道黏膜屏障發(fā)育和健全的重要成分，其降低提示腸道內菌群的顯著紊亂[3]。其余菌群的變化在MP-LPS組和LPS-control組中趨勢變化相同。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，健康小鼠長期應用糖皮質激素可使肺部和腸道微生態(tài)發(fā)生顯著的變化，而且兩者的變化具有差異性。肺部微生態(tài)變化以促炎反應相關的β-變形菌綱水平的降低，及與抗炎反應和SCFA產(chǎn)生增多相關的乳酸桿菌及毛螺菌等水平的增加為特點，這些均提示激素對肺部微生態(tài)有改善和促進作用，而激素對腸道微生態(tài)的影響與肺部有明顯不同，體現(xiàn)在ε-和β-變形菌綱的病原體水平顯著升高，但抗炎相關的乳桿菌屬的水平顯著降低，同時擬桿菌門、綱、目的水平也是顯著降低的，這提示糖皮質激素對腸道菌群有不良的影響，造成微生態(tài)的顯著紊亂。

作為一種經(jīng)典的免疫抑制藥物，糖皮質激素免疫作用機制仍有很多未知，在微生態(tài)的調節(jié)方面，雖然既往有相關研究，但結論仍有爭議。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，潑尼松龍以1.0 mg/kg共14 d并不會對實驗動物糞便微生態(tài)產(chǎn)生影響；另一項研究采用地塞米松DEX的28 d慢性暴露，腸道菌群發(fā)生了顯著變化，尤其是放線菌顯著升高，以放線菌屬(雙歧桿菌屬)顯著升高為特點。此外，與對照組相比，乳酸菌水平也有所增加[1]。糖皮質激素導致的雙歧桿菌和乳酸菌的升高，可能都與抗炎作用有關，這些結果可能指向一個以微生物為中心的抗炎機制。而本研究發(fā)現(xiàn)，長期大量糖皮質激素應用，會使肺部抗炎相關的微生態(tài)水平升高，但是腸道菌群出現(xiàn)顯著的紊亂，與先前的研究相比，考慮本研究中激素的用量更大，所以導致不同的結果，這也反映了不同的糖皮質激素使用方案對腸道菌群的影響是不同的。

當膿毒癥發(fā)生后，免疫抑制較免疫正常組肺部微生態(tài)出現(xiàn)了明顯的紊亂，這個結果意味著激素對健康個體肺部微生態(tài)的影響是很脆弱的，在感染打擊下，不但不會發(fā)揮調節(jié)作用，而且會加重微生態(tài)的失衡。對腸道微生態(tài)的分析也證明了這一點。LPS干預后，免疫抑制組腸道微生態(tài)出現(xiàn)變形菌門下各綱、目、科、屬水平較免疫正常組的顯著升高，這是腸道促炎環(huán)境惡化及機會感染增加的重要預警標志[2]，同時擬桿菌門的各級微生物也顯著減少，由于擬桿菌水平的穩(wěn)定是維持腸道菌群穩(wěn)定的重要因素，在一定程度上是促進腸道黏膜屏障發(fā)育和健全的重要成分，其降低提示腸道內菌群的顯著紊亂[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然膿毒癥啟動后腸道和肺部微生態(tài)均發(fā)生顯著變化，但是在膿毒癥早期(24 h)內，腸道和肺部發(fā)生同步變化的菌群種類較少，既往關于肺腸軸的理論指出，腸道和肺部緊密聯(lián)系且相互影響，在機體出現(xiàn)膿毒癥時，腸道菌群的失衡導致大量活性氧釋放，使腸道屏障受損，細菌可通過血液擴散至其他組織器官，最終引發(fā)炎癥級聯(lián)反應大暴發(fā)[5]。細菌移位后,肺是最先受到損傷的器官,說明腸源性感染是急性肺損傷的誘因。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，在健康小鼠的肺部，正常狀態(tài)下固有免疫反應更多反映了局部(肺-肺)微生物-宿主的相互作用，而不是遠程(腸道-肺)微生物-宿主的相互作用。這個結論反映了小鼠肺微生物組的存在和免疫意義，肺微生物群的變異可能是一個重要的，被低估的實驗和臨床變異的來源[5]。這也和本研究結論相契合，即膿毒癥早期，肺部微生態(tài)紊亂更多反映的是肺部自身的菌群失調，暫未受到腸道的廣泛影響，后期隨著病情加重或藥物影響等，肺腸軸的作用可能更加突出。

激素不會保護微生態(tài)。在某種用藥方式下，可能會增加某些抗炎菌群，但是由于其對免疫系統(tǒng)的影響，導致大量淋巴細胞凋亡，特別是B細胞，導致IgA分泌不足，同時也影響了免疫系統(tǒng)與微生態(tài)之間的相互平衡,也對腸道屏障功能造成了損傷。

在膿毒癥中，糖皮質激素一直以來是應用最廣泛、時間最長，且爭議最大的藥物。早期研究曾認為短期大劑量糖皮質激素(GC)對膿毒癥患者是有效的，而后期的研究發(fā)現(xiàn)這種方案不能帶來生存獲益，而且二重感染的風險進一步升高了。此后的研究著眼于短期低劑量激素(氫化可的松200～300 mg/d)，發(fā)現(xiàn)可以早期逆轉休克并改善生存率，然而隨著數(shù)據(jù)的積累，發(fā)現(xiàn)臨床結局的異質性越來越大，目前在膿毒癥的管理中，僅在限定條件下推薦GC的應用[6]。隨著轉錄組學技術的進步，人們發(fā)現(xiàn)其實膿毒癥和ARDS作為綜合征，其具有很大的異質性，如果根據(jù)其基因表型特點對患者進行更細致的分類[7]，有可能精準的區(qū)分出哪些患者可能從GC治療中獲益，哪些患者不但不能獲益，還會增加死亡的風險[8]。本研究中，通過生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，免疫抑制組在膿毒癥后死亡率顯著高于免疫正常組，結合肺部及腸道微生態(tài)的分析，本文認為通過肺部及腸道微生態(tài)紊亂的嚴重程度對膿毒癥進行分型是一種可行的方法，微生態(tài)紊亂的針對性治療，或者在GC治療的過程中充分考慮微生態(tài)的具體狀態(tài)，可能為膿毒癥的個體化治療提供思路。

總之，糖皮質激素會對健康個體的肺部及腸道微生態(tài)造成不同的影響，但當膿毒癥出現(xiàn)時，GC的長期大量應用會造成更加嚴重的肺部及腸道微生態(tài)紊亂。