書星，趙洋，孫敏，南玉奎，王慧琴，齊飛波

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，a 泌尿中心，b 科教中心，烏魯木齊 830002

原發(fā)性醛固酮增多癥(PA)簡稱原醛癥，是由于腎上腺皮質(zhì)球狀袋分泌過多的醛固酮所致。血漿中超出常規(guī)含量的醛固酮對腎臟、心臟、腦等器官有獨立于高血壓的損害作用[1]。PA的主要類型包括：雙側(cè)腎上腺增生(BAH)、醛固酮瘤(APA)、家族性醛固酮增多癥(FH)及腎上腺皮質(zhì)癌[2-4]，發(fā)病機制尚不清楚。

microRNAs(miRNAs)是短鏈非編碼RNA的一種，其長度為18～27個核苷酸，在超過30%的人類基因中，與靶mRNA的3‘非翻譯區(qū)(3‘UTR)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平進行調(diào)節(jié)[5]。miRNAs參與了體內(nèi)諸多的生物學(xué)進程[6]。miRNA功能異常會導(dǎo)致正常細(xì)胞過度增殖或癌變。在諸多致瘤miRNA中較為關(guān)鍵的是miR-21，其在多種腫瘤組織中均有高表達(dá)[7]。本研究通過對48例APA患者手術(shù)樣本進行分子生物學(xué)研究并構(gòu)建細(xì)胞模型，探討miR-21在該疾病發(fā)生中的潛在分子生物學(xué)機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院2016年1月至2018年6月就診的48例腎上腺醛固酮瘤患者的腫瘤與瘤旁組織，并保存于液氮中；其中女性31例，男性17例；年齡范圍21～58歲，年齡(42.0±10.2)歲。腫瘤大小1.2～3.9 cm，平均2.26 cm。本研究方案經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與材料 所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理確診，從距離腫瘤手術(shù)陰性切緣1 cm以外的腎上腺中切取瘤旁組織。miR-21、U6引物(上海生工生物工程股份有限公司)；人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞(HACC)259細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)；miR Neasy Mini kit試劑盒、QIAGE miScript Ⅱ RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、QIAGE miScript Ⅱ RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒及QIAGEN miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒購自德國QIAGEN公司；無血清培養(yǎng)基(Opti-MEMI)、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)均購自美國Invitrogen公司；10%胎牛血清購自Gibco；miR-21抑制物(miR-21·INH載體)及對照空載體(INH-NC)購自上海Gene公司；RAS、PTEN活性檢測試劑盒(生工生物)、caspase-3檢測試劑盒；免疫組織化學(xué)相關(guān)試劑及材料有我院病理科提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 miR-21相對表達(dá)量檢測

1.3.1.1 提取總RNA 通過Trizol法抽提總RNA，取凍存組織塊30～50 mg研磨，按照德國QIAGEN有限公司產(chǎn)品miR Neasy Mini Kit試劑盒說明書進行樣本總RNA提取。最后用超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo 美國)測定提取樣本的總RNA濃度及純度，保存樣本備用。

1.3.1.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 在逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時，參照德國QIAGE miScript Ⅱ RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行操作，反應(yīng)體系為20 μL：5×HIFlex Buffer 4 μL，10×Nucleics Mix 2 μL，RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA(濃度約為25 ng/μL)+RNase-Free H2O2共12 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，60 min；95 ℃，5 min。

1.3.1.3 實時熒光定量PCR反應(yīng) 采用QIAGEN miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒，反應(yīng)體系20 μL：2×Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，10×miScript Primer Assay 2 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，RNase-Free H2O25 μL，模板cDNA 1 μL。MiR-21特異性引物及U6內(nèi)參引物見表1。反應(yīng)條件：95 ℃，15 min，1個循環(huán)。94 ℃，15 s；55 ℃，30 s；70 ℃，30 s；40個循環(huán)。分別計算miR-21及U6基因的Ct值，ΔCt值代表基因的相對定量，ΔCt值=目的基因Ct值-同組內(nèi)參Ct值，ΔΔCt值=各樣本ΔCt值-最小ΔCt值，其表達(dá)的差異倍數(shù)用2-ΔΔCt值表示，實驗重復(fù)3次。

表1 miRNA-21及U6引物序列

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測PTEN、RASA1及caspase-3表達(dá) 采用SP法行免疫組織化學(xué)染色，PTEN細(xì)胞漿內(nèi)黃染為陽性，RASA1細(xì)胞槳和胞核內(nèi)黃染為陽性，caspase-3細(xì)胞核內(nèi)黃染為陽性。隨機取5個高倍鏡(10×40)下視野，0分≤10%，1分為11%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為≥76%。染色強度0分無染色，1分淡染色，2分棕染色，3分棕褐色。陽性為兩項積分和≥3分，陰性<3分。

1.3.3 Western Blot法檢測RASA1、PTEN及caspase-3表達(dá) 采用Western Blot凝膠成像法對組織及細(xì)胞模型中的蛋白表達(dá)情況進行半定量分析。稱取相同質(zhì)量組織樣本或吸取相同數(shù)量對數(shù)期培養(yǎng)細(xì)胞，對組織或細(xì)胞進行裂解并抽提獲得總蛋白，采用BCA法對蛋白進行定量，配平蛋白濃度，GAPDH為已知濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白對照，按照20 μL蛋白+5 μL蛋白上樣緩沖液混勻后置于金屬加熱器中100 ℃變性5 min。配置5%濃縮膠及12%分離膠，點樣后90 V電壓下電泳30 min，130 V電壓下電泳90 min，轉(zhuǎn)膜90 min，5%封閉液封閉2 h，孵育相應(yīng)一抗于4 ℃過夜，TBST洗3次，每次洗10 min，加二抗孵育2 h，TBST洗3次，每次洗10 min，隨即使用凝膠成像儀拍照和分析結(jié)果，以GAPDH作為陽性對照，選用PTEN/GAPDH、RASA1/GAPDH及caspase-3/GAPDH的灰度比值來代表腎上腺醛固酮瘤患者的腫瘤組織與瘤旁組織或HACC細(xì)胞模型中的相應(yīng)蛋白的相對含量。

1.3.4 HACC micR-21表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建 (1)細(xì)胞培養(yǎng)：人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞(HACC)細(xì)胞株HACC 259(購自北納生物)，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在10%新胎牛血清、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 IU/mL的RPMI1640培養(yǎng)液中置于5%二氧化碳、37 ℃飽和溫度的培養(yǎng)箱中。每48小時更換1次新鮮培養(yǎng)基并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。48～72 h用0.25%的胰蛋白酶消化傳代細(xì)胞1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：參照Lipofactamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，采用瞬時轉(zhuǎn)染法分別將miR-21高表達(dá)載體、miR-21抑制載體及空載體轉(zhuǎn)染入HACC細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染后6 h換含10%小牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以用于后續(xù)實驗。

1.3.5 HACC模型細(xì)胞生長曲線繪制 采用MTT法觀察細(xì)胞生長情況，并繪制細(xì)胞生長曲線，具體如下：(1)制備1 mL細(xì)胞懸液，空白對照以1 mL培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液，加入0.1 mL MTT于37 ℃孵育4 h；(2)加1 mLDTW脫色液，37 ℃至少靜置30 min，時甲質(zhì)顆粒充分溶解；(3)吸取200 μL上述溶解液至96孔板中，在酶標(biāo)儀上讀取光密度(OD)值，檢測波長570 nm，參考波長630 nm；(4)每隔48 h測量1個點，每個點平行測量3次取平均值；(5)按照OD值隨時間的變化情況繪制細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-21在腎上腺醛固酮瘤組織與瘤旁組織中的表達(dá)

2.1.1 miRNA-21實時熒光定量PCR檢測結(jié)果 使用U6基因作為內(nèi)參基因，腎上腺醛固酮瘤患者的腫瘤組織與瘤旁組織樣本中miR-21的熒光定量擴增曲線呈現(xiàn)為典型的S型平滑曲線，該結(jié)果說明此次熒光定量試驗反應(yīng)的擴增效率良好；溶解曲線呈現(xiàn)為單峰，說明此次熒光定量實驗反應(yīng)的特異性擴增良好。

2.1.2 miR-21的相對表達(dá)水平 通過2-ΔΔCt法計算腎上腺醛固酮瘤患者的瘤旁組織與腫瘤組織樣本中miR-21相對內(nèi)參U6的相對表達(dá)量。miR-21在腎上腺醛固酮瘤患者的腫瘤組織(0.109±0.050)中的表達(dá)量高于瘤旁組織(0.040±0.019)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.184，P<0.001)。

2.2 PTEN蛋白、RASA1蛋白及caspase-3蛋白在腎上腺醛固酮瘤癌組織與癌旁組織中的表達(dá)

2.2.1 RASA1 在腎上腺醛固酮瘤旁組織中陽性表達(dá)率為60.41%(29/48)，主要腎上腺細(xì)胞漿中；腎上腺瘤患者組陽性表達(dá)率為8.33%(4/48)，主要在細(xì)胞漿中。兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=28.860，P<0.001)(圖1)。

圖1 腎上腺醛固酮瘤組織與瘤旁組織RASA1免疫組織化學(xué)結(jié)果:A為RASA1陽性表達(dá)(IHC×100)；B為RASA1陰性表達(dá)(IHC×100)

2.2.2 caspase-3 caspase-3在兩組中均有陽性表達(dá)，陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核。在腎上腺醛固酮瘤旁組織中陽性表達(dá)率為89.58%(43/48)；腎上腺醛固酮瘤組織中的陽性表達(dá)率為25.00%(12/48)，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.447，P<0.001)(圖2)。

圖2 腎上腺醛固酮瘤組織與瘤旁組織caspase-3免疫組織化學(xué)結(jié)果：A為caspase-3陽性表達(dá)(IHC×100)；B為caspase-3陰性表達(dá)(IHC×100)

2.2.3 PTEN PTEN在腎上腺醛固酮瘤組織與腎上腺醛固酮瘤旁組織中均有陽性表達(dá)，陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿；在腎上腺醛固酮瘤旁組織中陽性表達(dá)率為85.42%(41/48)；腎上腺醛固酮瘤組織陽性表達(dá)率為22.92%(11/48)(圖3)。兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=37.762，P=0.001)。

圖3 腎上腺醛固酮瘤組織與瘤旁組織PTEN免疫組織化學(xué)結(jié)果：A為PTEN陽性表達(dá)(IHC×200)；B為PTEN陰性表達(dá)(IHC×200)

2.3 HACC細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 轉(zhuǎn)染HACC細(xì)胞后，Western Blot表達(dá)量檢測結(jié)果顯示，通過LSD法進行組間比較可知：轉(zhuǎn)染細(xì)胞使miR-21過表達(dá)時caspase-3蛋白表達(dá)量(0.531±0.008)與轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-21抑制表達(dá)時caspase-3蛋白表達(dá)量(0.279±0.003)與陰性對照組(0.422±0.006)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)；miR-21抑制表達(dá)組與miR-21過表達(dá)組caspase-3蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。

轉(zhuǎn)染后的HACC進行細(xì)胞生長分析，結(jié)果顯示：與陰性對照相比，miR-21抑制表達(dá)組細(xì)胞生長緩慢，生長受到抑制；miR-21過表達(dá)組細(xì)胞生長迅速，細(xì)胞呈現(xiàn)過度增殖趨勢(圖4)。

圖4 HACC生長曲線

3 討論

miR-21是在多種人類腫瘤中表達(dá)呈上調(diào)趨勢的一個公認(rèn)的非常重要的致癌基因[8]。目前已知miR-21的調(diào)控靶基因包括：PTEN[9]、RASA1[10]、caspase-3[11]等。

PTEN基因編碼的蛋白可以使三磷酸肌醇去磷酸化而負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路[12],引起細(xì)胞異常增殖[13]。PTEN的表達(dá)下調(diào)或突變失活間接激活mTORM通路誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生及進展，而PTEN是miR-21的靶基因，可通過對PTEN的調(diào)節(jié)誘發(fā)腫瘤或?qū)е履[瘤進展[14]。Ras基因是保守的抑癌基因，RASA1是最早被發(fā)現(xiàn)的RAS GAPs之一。caspase-3是caspase家族中最為重要的成員，調(diào)控細(xì)胞的凋亡。caspase-3的低表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡特性而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[15]。研究[16]表明，miR-21在多種腫瘤中的表達(dá)中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，其可同時對多種蛋白進行調(diào)控，造成細(xì)胞增殖代謝紊亂，PTEN、RASA1及caspase-3是其重要的靶向基因。

本研究發(fā)現(xiàn)：(1)miR-21在腎上腺醛固酮瘤組織中的表達(dá)明顯高于瘤旁組織，通過免疫組織化學(xué)試驗顯示，瘤組織中的PTEN、RASA1及caspase-3蛋白的表達(dá)均較瘤旁組織呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，表明瘤組織中miR-21的上調(diào)可能與PTEN、RASA1及caspase-3表達(dá)存在負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系。(2)miR-21抑制及過表達(dá)的HACC細(xì)胞模型，研究結(jié)果顯示，miR-21過表達(dá)組中caspase-3蛋白表達(dá)量與miR-21抑制組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；miR-21抑制組細(xì)胞生長受到抑制，而miR-21過表達(dá)組細(xì)胞呈現(xiàn)過度增長態(tài)勢，表明miR-21可能通過調(diào)控caspase-3蛋白的表達(dá)來降低細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

綜上所述，腎上腺醛固酮瘤中miR-21呈現(xiàn)高表達(dá)，通過下調(diào)RASA1、PTEN及caspase-3，從而抑制細(xì)胞凋亡參與腫瘤進展。