江 震， 沈喜妹， 楊立勇

脂毒性在2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。長(zhǎng)期暴露于高水平的游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)，如棕櫚酸(palmitic acid，PA)，可損害胰島β細(xì)胞功能，干擾細(xì)胞代謝途徑，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡[1]。本課題組前期研究顯示，PA主要通過(guò)激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)介導(dǎo)β細(xì)胞損傷[2-3]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、胰島素分泌障礙，但TLR4的下游靶信號(hào)有待進(jìn)一步明確。艾塞那肽(Exendin-4)是胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的類似物，在治療糖尿病方面擁有很好的應(yīng)用前景。Exendin-4可通過(guò)促進(jìn)β細(xì)胞增殖、抑制β細(xì)胞凋亡改善β細(xì)胞的功能。本研究擬探討TLR4下游信號(hào)c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)/Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X，Bax)通路在PA介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷過(guò)程中所起的作用，并探討應(yīng)用Exendin-4的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞：小鼠胰島素瘤細(xì)胞系βTc6購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。(2)試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司)；PA、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、SP600125(美國(guó)Sigma公司)；TLR4阻滯劑CLI-095(美國(guó)Invitrogen公司)；TLR4激動(dòng)劑LPS和JNK激動(dòng)劑anisomycin(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)；Exendin-4(以色列ProSpec-Tany公司)；小鼠胰島素ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；TLR4、JNK、p-JNK、Bax、Bcl-2、β-actin(美國(guó)Santa Cruz公司)；二抗抗體及Western-blot相關(guān)試劑(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將細(xì)胞分為對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基)、BSA組(0.5% BSA)和PA組(0.5 mmol/L的PA)，干預(yù)時(shí)間為24 h。

1.2.1.2 藥物干預(yù)

1.2.1.2.1 TLR4或JNK阻滯劑干預(yù)試驗(yàn) 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、PA組(0.5 mmol/L的PA干預(yù)24 h)、CLI-095組(3 μmol/L CLI-095處理細(xì)胞24 h)、SP600125組(25 μmol/L SP600125處理細(xì)胞24 h)、PA+CLI-095組(3 μmol/L CLI-095預(yù)處理細(xì)胞4 h，再予CLI-095+PA處理細(xì)胞24 h)和PA+SP600125組(25 μmol/L SP600125預(yù)處理細(xì)胞4 h，再予SP600125+PA處理細(xì)胞24 h)。

1.2.1.2.2 Exendin-4干預(yù)試驗(yàn) 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、PA組(0.5 mmol/L的PA干預(yù)24 h)、Exendin-4組(50 nmol/L Exendin-4干預(yù)24 h)和Exendin-4+PA組(50 nmol/L Exendin-4預(yù)孵育細(xì)胞24 h，再予Exendin-4+PA共同干預(yù)24 h)。

1.2.1.2.3 TLR4、JNK激動(dòng)劑或阻滯劑對(duì)Exendin-4干預(yù)試驗(yàn) 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為對(duì)照組(無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、CLI-095組(3 μmol/L CLI-095處理細(xì)胞24 h)、SP600125組(25 μmol/L SP600125處理細(xì)胞24 h)、LPS組(10 mg/L LPS干預(yù)24 h)、anisomycin組(10 μmol/L anisomycin干預(yù)24 h)、Exendin-4+PA組(50 nmol/L Exendin-4預(yù)孵育細(xì)胞24 h，再予Exendin-4+PA共同干預(yù)24 h)、CLI-095+Exendin-4+PA組(3 μmol/L CLI-095處理細(xì)胞4 h，再予Exendin-4+PA共同干預(yù)24 h)、SP600125+Exendin-4+PA組(25 μmol/L SP600125預(yù)處理細(xì)胞4 h，再予Exendin-4+PA共同干預(yù)24 h)、LPS+Exendin-4+PA組(10 mg/L LPS預(yù)處理細(xì)胞4 h，再予Exendin-4+PA共同干預(yù)24 h)、anisomycin+Exendin-4+PA組(10 μmol/L anisomycin預(yù)處理細(xì)胞4 h，再予Exendin-4+PA共同干預(yù)24 h)。

1.2.2 葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS)βTC6細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)各種實(shí)驗(yàn)因素干預(yù)特定時(shí)間后，吸棄培養(yǎng)液，用無(wú)糖克-林二氏重碳酸鹽緩沖液(KRBB)(pH值為7.4)洗滌2遍后，用37 ℃無(wú)糖KRBB 1 mL預(yù)處理30 min，吸棄KRBB，再洗滌細(xì)胞1遍，每孔加入37 ℃ KRBB(20 mmol/L葡萄糖)孵育刺激細(xì)胞60 min，收集細(xì)胞上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中胰島素水平 取100 μL樣品稀釋液、100 μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品至包被抗體的96孔板微孔中，覆蓋封板膜，37 ℃孵育2 h；移除各孔中液體，移液槍吸取100 μL生物素標(biāo)記抗體工作液加入各微孔中，覆蓋封板膜，37 ℃孵育1 h；吸取上清液，取300 μL 稀釋好的洗滌液至各微孔中，靜置1～2 min后，移除洗滌液，重復(fù)操作3次；移液槍吸取100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液加至各微孔中，覆蓋封板膜，于37 ℃中孵育1 h；重復(fù)上述洗滌操作5次；取90 μL TMB底物溶液至各微孔，避光操作。在37 ℃中孵育20 min，移液槍吸取50 μL終止液至各微孔中，使液體變黃。反應(yīng)終止后5 min內(nèi)在450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀中檢測(cè)各管OD值，并記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)。裂解上述細(xì)胞，按照Trizol及BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白，紫外分光光度計(jì)562 nm處檢測(cè)蛋白量。

1.2.4 Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞內(nèi)加入RIPA 200 μL和PMSF 2 μL，冰上裂解后吸取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取40 μL蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，與抗體TLR4(sc-8694，1∶1 000)、JNK(sc-571，1∶500)、p-JNK(sc-6254，1∶500)、Bax(sc-6236，1∶500)、Bcl-2(sc-7832，1∶500)或β-actin(sc-47778，1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，取膜與稀釋后的二抗(1∶5 000)室溫?fù)u晃1 h，ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 PA對(duì)β細(xì)胞胰島素分泌及TLR4/JNK/Bax信號(hào)表達(dá)的影響 PA干預(yù)βTC6細(xì)胞24 h后，βTC6細(xì)胞的GSIS水平降低(P<0.05)，同時(shí)TLR4、p-JNK、Bax蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax下降(P<0.05，表1，圖1)。

表1 PA對(duì)β細(xì)胞胰島素分泌及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

GSIS：葡萄糖刺激的胰島素分泌；BSA：牛血清白蛋白；PA：棕櫚酸。A：PA對(duì)胰島素分泌的作用；B：蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)；C：PA對(duì)TLR4、JNK、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的作用。與對(duì)照組比較，☆：P<0.05。圖1 PA對(duì)β細(xì)胞胰島素分泌及TLR4、JNK、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的作用Fig.1 The effect of PA on the insulin secretion and protein expression of TLR4，JNK，Bax and Bcl-2 in β cell

2.2 TLR4及JNK抑制劑對(duì)PA作用的影響 抑制TLR4活性，可拮抗PA引起的GSIS障礙(P<0.05)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)(P<0.05)，并上調(diào)Bcl-2蛋白水平和Bcl-2/Bax(P<0.05)；抑制JNK活性，亦可拮抗PA的上述損害作用(P<0.05，表2，圖2)。

表2 TLR4及JNK抑制劑對(duì)PA引起的β細(xì)胞胰島素分泌及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

GSIS：葡萄糖刺激的胰島素分泌。1：對(duì)照組；2：PA組；3：CLI-095組；4：SP600125組；5：PA+CLI-095組；6：PA+SP600125組。A：TLR4及JNK抑制劑對(duì)胰島素分泌的作用；B：蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)；C：TLR4及JNK抑制劑對(duì)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的作用。與對(duì)照組比較，☆：P<0.05；與PA組比較，#：P<0.05。圖2 TLR4及JNK抑制劑對(duì)PA引起的β細(xì)胞胰島素分泌及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的作用Fig.2 The effect of TLR4 and JNK inhibitors on the insulin secretion and protein expression of Bax and Bcl-2 induced by PA in β cell

2.3 Exendin-4對(duì)PA作用的影響 Exendin-4干預(yù)可改善PA誘導(dǎo)的β細(xì)胞GSIS障礙(P<0.05)，下調(diào)TLR4、p-JNK、Bax蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，并上調(diào)Bcl-2蛋白水平和Bcl-2/Bax(P<0.05，表3，圖3)。

表3 Exendin-4對(duì)PA引起的β細(xì)胞胰島素分泌及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

GSIS：葡萄糖刺激的胰島素分泌。A：Exendin-4對(duì)胰島素分泌的作用；B：蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)；C：Exendin-4對(duì)TLR4、JNK、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的作用。與對(duì)照組比較，☆：P<0.05；與PA組比較，#：P<0.05。圖3 Exendin-4對(duì)PA引起的β細(xì)胞胰島素分泌及TLR4、JNK、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的作用Fig.3 The effect of Exendin-4 on the insulin secretion and protein expression of TLR4, JNK, Bax and Bcl-2 induced by PA in β cell

2.4 調(diào)控TLR4或JNK活性對(duì)Exendin-4干預(yù)脂毒性β細(xì)胞胰島素分泌作用的影響 抑制TLR4/JNK活性可增加Exendin-4改善脂毒性β細(xì)胞GSIS障礙的作用；反之，增強(qiáng)TLR4/JNK活性可削弱Exendin-4改善脂毒性β細(xì)胞GSIS障礙的作用(P<0.05，表4，圖4)。

表4 TLR4或JNK的激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)Exendin-4干預(yù)脂毒性β細(xì)胞胰島素分泌的影響

1：對(duì)照組；2：CLI-095組；3：SP600125組；4：LPS組；5：anisomycin組；6：Exendin-4+PA組；7：CLI-095+Exendin-4+PA組；8：SP600125+Exendin-4+PA組；9：LPS+Exendin-4+PA組；10：anisomycin+Exendin-4+PA組。TLR4激動(dòng)劑和JNK激動(dòng)劑及TLR4阻滯劑和JNK阻滯劑對(duì)Exendin-4干預(yù)脂毒性β細(xì)胞胰島素分泌的作用。與對(duì)照組比較，☆：P<0.05；與Exendin-4+PA組比較，#：P<0.05。圖4 調(diào)控TLR4或JNK活性對(duì)Exendin-4干預(yù)脂毒性β細(xì)胞胰島素分泌的作用Fig.4 Regulating the activity of TLR4 or JNK affected the protective role of Exendin-4 on the insulin secretion of lipotoxic β-cells

3 討 論

糖尿病患病率不斷飆升，肆虐人類健康，而延緩胰島β細(xì)胞功能持續(xù)惡化是當(dāng)今防治糖尿病的主要策略。研究顯示，脂毒性是誘導(dǎo)β細(xì)胞胰島素分泌功能失代償和衰竭的重要機(jī)制[4]。本課題組前期研究證實(shí)，脂毒性誘導(dǎo)的代謝性炎癥是代謝壓力引起β細(xì)胞功能衰退的關(guān)鍵病理機(jī)制，但尚缺乏特異干預(yù)措施[5]。

代謝性炎癥是胰島β細(xì)胞對(duì)糖脂代謝應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，但持續(xù)的代謝免疫失衡可不斷削弱β細(xì)胞的適應(yīng)性修復(fù)能力，誘導(dǎo)β細(xì)胞靜默[6]，最終導(dǎo)致β細(xì)胞功能衰竭和凋亡。本課題組前期的體內(nèi)外研究顯示，脂代謝壓力可誘導(dǎo)β細(xì)胞持續(xù)的代謝炎癥損傷，致使β細(xì)胞最終應(yīng)激失代償以及凋亡[7-9]。TLR4是介導(dǎo)上述代謝性炎癥損傷的樞紐調(diào)控因子：TLR4是脂毒性誘導(dǎo)β細(xì)胞損傷的必需因素之一，但TLR4通過(guò)怎樣的分子機(jī)制誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞代謝應(yīng)激失代償有待探討。為此，在原有研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討PA誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能損傷與TLR4下游信號(hào)分子JNK和Bax的關(guān)系。結(jié)果顯示，PA誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能損傷的同時(shí)，誘導(dǎo)TLR4及下游信號(hào)分子JNK和Bax高表達(dá)，提示PA誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能損傷與TLR4/JNK/Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。既往研究也支持該研究結(jié)果：活化的JNK在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2分子介導(dǎo)線粒體途徑引起的凋亡[10]。Bax和Bcl-2作為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的代表，相互之間產(chǎn)生拮抗作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控[11]。Bcl-2和Bax兩蛋白間的比例關(guān)系是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，Bax升高促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2升高則抑制細(xì)胞凋亡[11]。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，Bax由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體并與線粒體膜結(jié)合，使得細(xì)胞色素酶C穿過(guò)線粒體膜，激活caspase-9，繼而活化caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12-13]。目前，國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者把細(xì)胞Bcl-2/Bax作為判斷細(xì)胞凋亡被抑制或加強(qiáng)的主要標(biāo)志之一[14]。研究證實(shí)，鏈脲佐菌素或高糖干預(yù)下的INS-1細(xì)胞，通過(guò)激活JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，PA可增加β細(xì)胞p-JNK和Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，使Bcl-2/Bax降低，抑制TLR4或JNK活性均可拮抗PA的作用，提示TLR4的介導(dǎo)作用可能活化JNK/Bax信號(hào)通路。TLR4/JNK/Bax通路可能在PA誘導(dǎo)脂毒性效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本研究進(jìn)一步探討降糖藥物Exendin-4對(duì)TLR4/JNK/Bax通路的作用。Exendin-4作為GLP-1的類似物，具有改善胰島β細(xì)胞功能和非胰島素依賴途徑降血糖、維持糖化血紅蛋白穩(wěn)定等特點(diǎn)[17]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，Exendin-4可抑制脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的氧化應(yīng)激[2]，這一保護(hù)機(jī)制與抑制TLR4信號(hào)通路有關(guān)，由此推測(cè)TLR4是Exendin-4拮抗脂毒性效應(yīng)的一個(gè)調(diào)控靶點(diǎn)，具體機(jī)制有待探討。本研究發(fā)現(xiàn)，Exendin-4下調(diào)PA所致的p-JNK水平的升高，推測(cè)Exendin-4可通過(guò)干預(yù)JNK信號(hào)途徑起保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用。同時(shí)，Exendin-4干預(yù)后Bax蛋白表達(dá)下調(diào)、Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明Exendin-4通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2蛋白的比例拮抗PA的脂毒性效應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)，激活TLR4或JNK的活性可削弱Exendin-4改善脂毒性β細(xì)胞胰島分泌功能的作用，反之抑制兩者的活性均可增加Exendin-4的良性干預(yù)作用，可見(jiàn)Exendin-4的干預(yù)作用與抑制TLR4/JNK/Bax信號(hào)通路有關(guān)。目前鮮有報(bào)道Exendin-4通過(guò)TLR4介導(dǎo)胰島β細(xì)胞脂毒性保護(hù)作用機(jī)制涉及其下游信號(hào)通路JNK/Bax，本研究對(duì)Exendin-4發(fā)揮脂毒性保護(hù)作用提供了新的補(bǔ)充。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PA引起胰島β細(xì)胞功能障礙可能與TLR4/JNK/Bax通路有關(guān)；而Exendin-4則可抑制PA誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞GSIS障礙，下調(diào)TLR4、p-JNK和Bax的表達(dá)，并上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。Exendin-4抑制脂毒性誘導(dǎo)的TLR4/JNK/Bax通路活化可能是其保護(hù)胰島β細(xì)胞功能的機(jī)制之一。本研究也存在局限性：(1)缺乏相關(guān)靶基因的敲除或過(guò)表達(dá)，以便進(jìn)一步驗(yàn)證因果關(guān)系；(2)尚需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)體外的研究結(jié)果。