鄒高煥， 許孟飛， 唐雅君， 江孫穎， 鄭舒敏， 楊宇豪， 魏雅嵐， 佘振宇

生殖生物學(xué)是生命科學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是研究生殖活動及其基本規(guī)律的自然科學(xué)。WHO報告表明，不孕不育癥已成為僅次于腫瘤和心血管疾病的第三大疾病。全球有4 800萬對夫婦和1.86億人患有不孕不育癥。我國每8對育齡夫婦中有1對患不孕不育癥，發(fā)病率為12.5%～15.0%。約30%的不孕不育癥由男性不育導(dǎo)致，其中7%為精子質(zhì)量問題，包括無精子癥、少精子癥、弱精子癥和精子無力癥等[1]。生精功能異常、染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常是男性不育癥的主要原因[2]。

精子發(fā)生包括精原細(xì)胞增殖、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成等階段[3]。減數(shù)分裂對同源染色體分離、染色體穩(wěn)定性與生育能力維持至關(guān)重要。小鼠是生殖生物學(xué)常用的動物模型之一[4]，其減數(shù)分裂起始于10 d齡。但2～3周齡小鼠的睪丸未沉降至陰囊，無法直接注射抑制劑或藥物。早期小鼠睪丸抑制模型和減數(shù)分裂相關(guān)研究較為困難。本研究擬通過小鼠腹腔手術(shù)和睪丸生精小管注射法，實現(xiàn)睪丸內(nèi)蛋白抑制，建立一種高效且簡便的雄性減數(shù)分裂研究模型，為生殖生物學(xué)研究提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級20～30 g ICR雄性小鼠(3周齡)，由福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：2015000519041，實驗動物許可證號：SYXK(閩)2016-0007]。

1.1.2 實驗材料 Eg5抑制劑Dimethylenastron母液(200 mmol/L，MedChemExpress，貨號：HY-19944)；切片石蠟、蘇木精溶液、伊紅、鹽酸、乙醇、二甲苯、碳酸鋰、中性樹膠、恒溫水浴鍋(DK-S22，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；石蠟超薄切片機(jī)(RM2235，德國Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(Ti-S2，日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備 小鼠術(shù)前1 h斷食斷水。手術(shù)器械、1 × 磷酸鹽緩沖液、槍頭等物品高溫高壓滅菌(121 ℃，30 min)。

1.2.2 小鼠麻醉、固定及備皮 右手抓取小鼠尾部，置于籠蓋上方，左手拇指與示指抓住小鼠頸背部皮膚。拎起后左手環(huán)指按住左腿，小指抓住鼠尾及右腿。腹中線處以30°～60°進(jìn)針，深度不超過1 cm。進(jìn)針后局部皮膚凹陷消失，并有落空感，回抽未見血后行腹腔注射10%水合氯醛，劑量為50 μL/10 g體質(zhì)量[5]。注意不要刺入過深損傷內(nèi)臟，或只進(jìn)入皮下而未進(jìn)入腹腔。麻醉完全后捆綁小鼠四肢，仰臥位固定于蠟盤，行下腹部至尿道口備皮。

1.2.3 腹腔手術(shù) 右手執(zhí)筆式持手術(shù)刀，左手拇指和食指繃緊切口上端兩側(cè)皮膚，取下腹部正中切口逐層切開。保持切口5～10 mm，內(nèi)外大小一致，充分暴露手術(shù)野。

1.2.4 睪丸注射 手術(shù)鑷夾住小鼠外皮層，牽拉脂肪體，可見腹部兩側(cè)睪丸(特征為淡黃色，分布有紅色睪丸動脈袢)，輕夾至體外。鑷子固定睪丸，注射器穿刺進(jìn)行睪丸注射。緩慢注射后停留5 s拔出注射器，使藥物通過生精小管擴(kuò)散至整個睪丸(圖1)。將50只小鼠隨機(jī)分為對照組和實驗抑制組。對照組注射10 μL 0.05%臺盼藍(lán)或磷酸鹽緩沖液，實驗抑制組注射10 μL 0.075% Dimethylenastron抑制劑。

A：腹部正中線腹部開口1 cm；B：逐層切開皮膚、筋膜層、腹膜；C：用鑷子夾取睪丸至體外；D：使用1 mL注射器注射藥物。圖1 小鼠腹腔手術(shù)和睪丸生精小管注射的關(guān)鍵步驟Fig.1 Key steps of intraperitoneal surgery and testicular seminiferous tubule injection in mice

1.2.5 手術(shù)傷口縫合及術(shù)后護(hù)理 注射完成后，將睪丸輕推回腹腔，單純間斷縫合。苦味酸標(biāo)記不同實驗組小鼠，放回鼠籠，注意術(shù)后保暖和護(hù)理。

1.2.6 組織包埋、H-E染色和形態(tài)學(xué)觀察 小鼠麻醉，切開腹腔，手術(shù)剪分離睪丸。睪丸經(jīng)10%甲醛水溶液固定18 h，50%乙醇30 min，70%乙醇40 min，85%乙醇40 min，95%乙醇50 min，100%乙醇50 min，二甲苯30 min。65 ℃石蠟浸泡90 min，石蠟室溫包埋過夜。超薄切片機(jī)行5 μm超薄切片，40 ℃水浴鍋展片，37 ℃干燥24 h備用。

石蠟切片經(jīng)無水乙醇6 min，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各2 min。Mayer’s蘇木素染色5 min，自來水5 min，蒸餾水2 min。1%鹽酸乙醇溶液分色3 s后自來水洗3 min。碳酸鋰飽和溶液返藍(lán)1 min，蒸餾水洗2 min。1%伊紅溶液5 min，95%乙醇脫水10 s，100%乙醇脫水3 min，二甲苯透明20 min，中性樹膠封固。

2 結(jié) 果

小鼠共50只，術(shù)后死亡3只，存活率為94.0%，表明腹腔手術(shù)睪丸注射模型的小鼠存活率較高。術(shù)后小鼠的腹部切口完全愈合，無感染癥狀，生存狀態(tài)良好。對照組和實驗抑制組的小鼠體質(zhì)量、小鼠睪丸質(zhì)量、睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量比比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組和實驗抑制組的小鼠睪丸長徑分別為(0.68±0.01)和(0.73±0.02)cm，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)。兩組小鼠睪丸的外形均完整，形態(tài)正常且無明顯差異。對照組和實驗抑制組小鼠睪丸的質(zhì)量分別為(79.19±4.80)和(85.00±4.39)mg(圖2)，表明Dimethylenastron抑制劑注射對睪丸質(zhì)量無明顯影響。

石蠟切片和H-E染色可見，實驗抑制組的睪丸生精小管內(nèi)處于減數(shù)分裂的精母細(xì)胞數(shù)量增加，減數(shù)分裂中期染色體排列紊亂，部分染色體無法整齊排列。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，Eg5抑制后生精小管的中期阻滯精母細(xì)胞數(shù)比例為(12.81±1.12)%，而對照組為(0.18±0.12)%，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖2)，表明Dimethylenastron介導(dǎo)的Eg5蛋白抑制導(dǎo)致精母細(xì)胞中期停滯，細(xì)胞周期停滯和減數(shù)分裂染色體排列異常。

A：小鼠體質(zhì)量比較；B：小鼠睪丸質(zhì)量比較；C：睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量比比較；D：小鼠睪丸長徑比較；E：對照組生精小管(H-E染色 ×40)；F：Eg5抑制組生精小管(H-E染色 ×40)；G：中期停滯精母細(xì)胞比例比較。圖2 小鼠睪丸內(nèi)Eg5抑制導(dǎo)致精母細(xì)胞中期停滯和減數(shù)分裂染色體排列異常Fig.2 Eg5 inhibition in mouse testes led to spermatocyte metaphase arrest and abnormal meiotic chromosome alignment

3 討 論

本研究介紹了腹腔手術(shù)進(jìn)行睪丸注射模型的建立過程，通過腹腔手術(shù)成功實現(xiàn)Dimethylenastron介導(dǎo)的Eg5蛋白抑制，完成對小鼠睪丸內(nèi)Eg5蛋白的抑制和減數(shù)分裂的相關(guān)研究，驗證了實驗?zāi)Ｐ偷目尚行?。本研究具有以下?yōu)點：(1)不受小鼠年齡限制，可對2～3周齡小鼠的未沉降睪丸進(jìn)行抑制劑注射，完成精子發(fā)生早期減數(shù)分裂的功能及機(jī)制研究。(2)可實現(xiàn)精準(zhǔn)注射，避免因睪丸表面血管破裂出血或睪丸貫穿傷造成睪丸壞死。(3)腹腔手術(shù)睪丸注射可準(zhǔn)確控制藥物用量，添加臺盼藍(lán)指示劑可輔助注射實驗和提高手術(shù)效率。(4)對生殖系統(tǒng)傷害較小，且陰囊壁完整。

小鼠是最典型的模式動物之一，使用也最為廣泛。因此，小鼠睪丸注射抑制模型的建立對減數(shù)分裂及睪丸的研究提供了技術(shù)參考。既往的研究多采用直接經(jīng)陰囊注射藥物，操作簡便、創(chuàng)口小，但易出血且無法判斷藥物是否注入睪丸內(nèi)及是否造成睪丸貫穿傷，存在多種不確定因素[6-7]。此外，還有睪丸網(wǎng)注射和睪丸間質(zhì)注射等方法[8]。上述注射法在睪丸兩側(cè)作切口，暴露睪丸進(jìn)行注射。睪丸網(wǎng)注射需在顯微鏡下操作，對實驗人員技術(shù)操作要求高；而睪丸間質(zhì)注射對睪丸機(jī)械損傷過大，穿孔較多。上述幾種方法均對睪丸及陰囊壁造成不同程度的損傷。傳統(tǒng)陰囊注射法要求實驗小鼠的睪丸沉降至陰囊，

一般需要鼠齡超過4周齡，對實驗限制多，不利于減數(shù)分裂等精子發(fā)生的早期相關(guān)研究。另外，傳統(tǒng)陰囊直接注射法較難保證注射的準(zhǔn)確性，而腹腔手術(shù)睪丸注射法可保證注射位置的準(zhǔn)確性和觀察藥物的擴(kuò)散程度。不同的實驗操作手法及選用不同試劑，對睪丸損傷程度尚無定論[8]。

小鼠腹腔手術(shù)睪丸注射實驗?zāi)Ｐ腿源嬖谝恍┬枰P(guān)注的問題：小鼠麻醉劑的選擇及其劑量；小鼠腹壁腹膜較薄，行腹腔手術(shù)時易傷及血管臟器，引發(fā)出血，污染手術(shù)野和導(dǎo)致術(shù)后感染，使小鼠存活率降低。腹腔手術(shù)臟器暴露時間與小鼠感染幾率存在一定相關(guān)性，能否快速找到睪丸是本實驗的難點，且縫合不當(dāng)易引起術(shù)后腹膜粘連等問題[9]，因此，要求實驗人員熟練掌握各步驟方法。在小鼠腹腔手術(shù)過程，手術(shù)切口的位置選擇在尿道口上方5 mm處，通過輕輕牽拉脂肪體定位睪丸和體視顯微鏡輔助觀察，可加快尋找睪丸的速度和提高注射的精確性。在實驗?zāi)Ｐ徒⑦^程中，提高無菌操作技術(shù)、減少傷口大小、術(shù)后合理使用抗菌藥物和加強(qiáng)術(shù)后護(hù)理，有助于提高手術(shù)安全性，減少術(shù)后并發(fā)癥和提高小鼠術(shù)后存活率及實驗成功率。