劉玉林，臧玉琴，王穎梅，薛鳳霞

（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院婦產科；天津市女性生殖健康與優(yōu)生重點實驗室，天津 300052）

宮頸癌作為常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅著女性的健康。據(jù)統(tǒng)計，每年全球有超過50萬名女性被診斷為宮頸癌、超過30萬名女性死于宮頸癌。宮頸癌最常見的組織學亞型為宮頸鱗狀細胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSC）和宮頸腺癌，分別占所有宮頸癌的70%和25%[1]。絕大部分宮頸癌的發(fā)病是由高危型人乳頭瘤病毒（human pa pilloma virus，HPV）感染引起的，其發(fā)病過程多為正常宮頸感染高危型HPV后，產生宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），隨后CIN逐漸由低級別病變進展為高級別病變，最后進一步發(fā)展為侵襲性宮頸癌。HPV是一種非包膜病毒，具有雙鏈環(huán)狀DNA基因組，可以整合到宿主基因組中，隨后導致E2蛋白失活，E6和E7癌蛋白表達失調，進而引起宮頸癌變。然而，該過程的具體分子機制仍有待深入研究，且晚期遠處轉移或復發(fā)患者的生存率仍較低，新的診斷分子標志物及治療靶點仍有待發(fā)掘。

生物信息學分析是研究人類疾病分子變化的常用方法，可以方便地在高通量平臺上比較不同樣本之間基因表達的差異，以獲得疾病相關基因信息?；蛐酒╣ene microarray），又稱基因微陣列，是目前生物信息學中常用的工具，通過將成千上萬的核酸探針固定在該芯片上，可一次性檢測大量基因的表達情況。關于宮頸癌與正常宮頸組織之間差異表達基因的生物信息學分析已有數(shù)項研究，但尚無對正常宮頸上皮-CIN-宮頸癌這一進展過程中的差異表達基因進行綜合性生物信息學分析的研究。因此，筆者在本研究中分別比較了正常宮頸上皮與CIN之間以及CIN與宮頸癌之間差異表達的基因，綜合二者結果，得到在宮頸癌進展過程中的差異表達基因，并對以上基因進行一系列的生物信息學分析，以篩選出最有可能在該過程中發(fā)揮重要作用的關鍵基因，為尋找宮頸癌分子標志物和治療靶點提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)的選擇在GEO（the Gene Expression Omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中檢索宮頸癌進展相關的基因芯片數(shù)據(jù)，選取了數(shù)據(jù)集GSE63514和GSE86100。GSE63514是基于Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺的mRNA表達數(shù)據(jù)集，包含24個正常宮頸上皮標本、76個CIN標本（14個CIN1標本、22個CIN2標本、40個CIN3標本）和28個CSC標本的mRNA表達信息。GSE86100是基于Agilent-046064 Unrestricted Human miRNA V19.0 Microarray平臺的miRNA表達數(shù)據(jù)集，包含6個非HPV感染的正常黏膜組織樣本和6個高危型HPV感染的宮頸癌組織樣本的miRNA表達信息。

1.2 差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）和差異表達miRNA（differentially expressed miRNA，DEM）的篩選通過GEO數(shù)據(jù)庫中的分析軟件GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），對數(shù)據(jù)集GSE63514中的正常宮頸上皮標本與CIN標本以及CIN標本與CSC標本之間的基因表達差異進行比較，以∣Log FC∣≥1（即差異倍數(shù)大于等于2倍）為界，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義，篩選出各組間具有表達差異的基因，并將在兩組結果中均為表達上調或均為表達下調的基因，視為在宮頸上皮由正常組織至癌前病變再至癌這一過程中的DEG；對數(shù)據(jù)集GSE86100中的正常組織標本與宮頸癌標本之間的miRNA表達差異進行比較，同樣以∣Log FC∣≥1和P<0.05為界，得到宮頸癌發(fā)生過程中的DEM。隨后，利用Morpheus網站（https://software.broadinstitute.org/morpheus/）做出基因差異表達的熱圖，以便更為直觀地顯示其在各標本中的表達情況。

1.3 DEG的功能及通路富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫（The Database for Annotation，Visualization and In tegrated Discovery，http://david.abcc.ncifcrf.gov/），對篩選得到的DEG進行了GO（Gene Ontology，http：//geneontology.org/）功能富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedi a of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/）通路富集分析，從而獲取以上DEG涉及的主要生物學過程（biological processes，BP）、分子功能（molecular functions，MF）和細胞定位（cellular components，CC）以及信號通路方面的信息。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建和亞網絡分析利用STRING 10.0（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，http：//string-db.org/）獲得DEG編碼蛋白之間的互相作用關系，將總得分>0.4設置為閾值，經由Cytosca pe 3.5.0（http://www.cytoscape.org/）構建出PPI網絡，以可視化形式顯示蛋白間的相互作用，并用Net work Analyzer工具對PPI網絡行進一步分析。隨后，使用插件MCODE（Molecular Complex Detection，http://apps.cytoscape.org/apps/mcode）進行亞網絡分析，并對亞網絡中涉及的基因行進一步的功能和通路富集分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 miRNA-靶基因調控網絡的構建通過使用在線工具WebGestalt（http://www.webgestalt.org）對第一步篩選得到的DEG進行miRNA-靶基因分析，并使用Cytoscape構建出miRNA-靶基因調控網絡。

2 結果

2.1 DEG和DEM篩選結果基于數(shù)據(jù)集GSE63514，在正常宮頸上皮樣本與CIN樣本間篩選出1 318個表達存在差異的基因，在CIN和CSC樣本間篩選出1 575個表達存在差異的基因。其中250個基因（包括118個上調基因和132個下調基因）在兩組結果中同為上調或下調（圖1A），表明該部分基因既參與了正常宮頸上皮向CIN轉化的過程，又參與了CIN向宮頸癌轉化的過程，故將其鑒定為本研究中宮頸癌進展過程中的DEG，其前100個基因的表達熱圖圖1B、1C?；跀?shù)據(jù)集GSE86100，共篩選出166個DEM，包括74個上調的DEM和92個下調的DEM，其前50個基因的表達熱圖見圖1D。

圖1 DEG和DEMFig 1 Identification of DEG and DEM

2.2 GO和KEGG功能和通路富集分析表1展示了針對DEG進行的GO和KEGG分析的主要結果。從表中可以看到，宮頸癌進展過程中DEG主要富集于“monocarboxylic acid transport（單羧酸運輸）”、“l(fā)ipoxygenase pathway（脂氧合酶途徑）”、“oocyte maturation（卵母細胞成熟）”、“oxidation-reduction process（氧化還原過程）”和“mitotic nuclear division（有絲分裂核分裂）”等生物學過程；“single-stranded DNA-dependent ATPase activity（單鏈DNA依賴的ATP酶活性）”、“monocarboxylic acid transmembrane transporter activity（單羧酸跨膜轉運體活性）”、“oxi doreductase activity（氧化還原酶活性）”、“protein homodimerization activity（蛋白同源二聚化活性）”和“ATPase activity（ATP酶活性）”等分子功能；以及“Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝）”、“Serotonergic synapse（血清素突觸通路）”、“Chemokine signaling pathway（趨化因子信號通路）”、“Proteoglycans in cancer（腫瘤中的蛋白聚糖）”和“Mismatch repair（錯配修復）”等通路。

表1 宮頸癌進展相關DEG的GO和KEGG富集分析結果Tab 1 Results of GO and KEGG analyses of the DEG associated with the progression of cervical cancer

2.3 PPI網絡和亞網絡構建和分析如圖2所示，PPI網絡由123個節(jié)點（node）和283項互相作用（edge）構成，其中123個節(jié)點包括67個上調的DEG和56個下調的DEG編碼的蛋白；網絡中與其他蛋白作用最多的前15個樞紐蛋白的編碼基因分別為：RFC4、SMC4、STAT1、KNTC1、ATAD2、FBXO5、TRIP13、ESR1、CD44、CENPN、ANLN、CDK2、ECT2、KIF14和POLQ（表2）。結合DEG的GO和KEGG富集分析，可以得到以上樞紐基因參與的富集功能與通路的情況：富集于“有絲分裂核分裂”的有FBXO5、KNTC1、CDK2、ANLN和CENPN，富集于“單鏈DNA依賴的ATP酶活性”的有RFC4和POLQ，富集于“ATP酶活性”的有KIF14和ATAD2，富集于“腫瘤中的蛋白聚糖”的有CD44和ESR1，富集于“蛋白同源二聚化活性”的有ECT2和STAT1，富集于“卵母細胞成熟”的有TRIP13和FBXO5，富集于“錯配修復”的有RFC4，富集于“趨化因子信號通路”的有STAT1。圖3A、3C、3E展示的是從PPI網絡中提取的得分大于4的3個亞網絡?？捎每吹?，除ESR1和AR以外，3個亞網絡中其他所有的DEG均為表達上調者。圖3B、3D、3F展示的分別是亞網絡中涉及DEG的GO和KEGG分析結果（僅顯示前3位）。

圖3 PPI亞網絡及GO和KEGG富集分析Fig 3 Significant modules of the PPI network and GO and KEGG enrichment analyses

表2 PPI網絡中的樞紐基因Tab 2 The hub genes in the PPI network

圖2 PPI網絡Fig 2 PPI network

2.4 miRNA-靶基因調控網絡miRNA-靶基因調控網絡如圖4所示，由66個節(jié)點組成，包括30個DEG和36個miRNA，節(jié)點間共有137個相互作用。

圖4 miRNA-靶基因調控網絡Fig 4 miRNA-target regulatory network

由圖可見，該網絡中的大多數(shù)的DEG為表達上調者，且同時為PPI網絡中的樞紐基因；網絡中約三分之一的miRNA為第1部分結果中篩選出的DEM，且與樞紐基因存在密切聯(lián)系。例如，miR-20A、miR-20B、miR-106C和miR-17-5P均為DEM，而且能靶向調控PPI網絡中的樞紐基因ATAD2（ATPase family，AAA domain containing 2，ATP酶家族蛋白2）、SMC4（structural maintenance of chromosomes 4，染色質結構維持蛋白4）和POLQ（DNA polymerase theta，DNA聚合酶θ）。

3 討論

宮頸癌是發(fā)展中國家最常見的婦科惡性腫瘤，是導致女性因癌癥死亡的第二大原因[1]，其癌前病變?yōu)镃IN，最常見的亞型為CSC。為了探索宮頸癌進展的分子機制以及篩選潛在的分子標志物及治療靶點，基于數(shù)據(jù)集GSE63514和GSE86100，對正常宮頸上皮樣本、CIN樣本和宮頸癌樣本進行了生物信息學分析。在本研究中，共篩選出宮頸癌發(fā)生、發(fā)展相關的118個上調DEG和132個下調DEG以及74個上調DEM和92個下調DEM，并通過生物信息學分析的方法，對其進行了功能和通路富集分析及PPI網絡和亞網絡以及miRNA-靶基因調控網絡的構建和分析，從而進一步篩選出可能在宮頸癌進展過程中起關鍵作用的DEG和DEM。

本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-靶基因調控網絡中的部分miRNA為本研究篩選得到的DEM，部分基因為PPI網絡中樞紐蛋白的編碼基因。最值得注意的是DEM miR-20A、miR-20B、miR-106B和miR-17-5P，以及它們共同調控的ATAD2、POLQ和SMC4，以上3個DEG不僅為PPI網絡中的樞紐基因和第1個亞網絡的構成節(jié)點，而且三者彼此之間均存在互相作用。因此，受miR-20A、miR-20B、miR-106B和miR-17-5P調控的基因ATAD2、SMC4和POLQ極有可能在宮頸癌的進展中發(fā)揮著重要的作用。

ATAD2編碼的蛋白為ATP酶家族蛋白2，能夠干預基因組的調控，包括細胞增殖、分化和凋亡。在人類多種癌癥中均檢測到ATAD2的過度表達，包括口腔鱗狀細胞癌、食道鱗狀細胞癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌以及結直腸癌等；而且ATAD2蛋白還被認為是腫瘤的“增殖驅動者”、“轉錄共調節(jié)因子”和“凋亡負性調節(jié)因子”，并已通過基因敲低研究證實其為一種相當有前景的抗癌藥物。與目前研究結果相吻合，在一項針對宮頸癌circRNA-miRNA-mRNA網絡的研究中[2]，ATAD2也被確定為樞紐基因；另外，經臨床資料分析及體外實驗證實，ATAD2的確在促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[3]。

SMC4是編碼染色質結構維持蛋白4的基因，該編碼蛋白是參與染色體濃縮和分離的復合物的核心亞基。研究發(fā)現(xiàn)，SMC4蛋白的有絲分裂特異性磷酸化可以降低濃縮素在染色體上的動態(tài)轉換率[4]，且與ATAD2相似，SMC4蛋白也含有ATPase結構域，其失活可導致細胞的死亡[5]。關于SMC4在乳腺癌、胰腺導管癌、肝細胞癌、肺腺癌和神經膠質瘤等癌癥中過表達的報道有很多，但迄今為止尚無其在宮頸癌中表達情況的報道。有關SMC4在宮頸癌中的唯一研究是SMC4蛋白可以負性調控主基因組調控蛋白CTCF（CCCTC-binding factor，CCCTC結合因子），后者能夠介導核糖體RNA基因的轉錄[6]。但在其他類型的癌癥中，SMC4已被證明在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用，例如，敲低SMC4將導致前列腺癌細胞系DU145和LNCaP-AR的遷移和侵襲顯著減少[7]。

POLQ是蛋白質DNA聚合酶θ的編碼基因，像ATAD2和SMC4一樣，DNA聚合酶θ也具有ATPase活性。其作用主要在于影響DNA復制和修復由各種因素（例如核酸內切酶和Cas9切口酶）引起的DNA雙鏈斷裂[8]。據(jù)研究報道，POLQ在包括乳腺癌、大腸癌、肺癌在內的多種癌癥中表達上調，并與患者的不良預后相關。另有多項研究表明，POLQ缺陷的人類腫瘤細胞系對放射線和其他雙鏈斷裂劑敏感，意味著POLQ極有可能被用作治療癌癥的藥物靶標。然而在宮頸癌中，本研究是首次發(fā)現(xiàn)POLQ作為潛在的促癌基因的作用。

此外，由miRNA-靶基因調控網絡的結果可見，ATAD2、SMC4和POLQ三者還同時與miR-20A、miR-20B、miR-106B和miR-17-5P存在關聯(lián)，而以上miRNA又均受HPV蛋白E6/E7的調控[9-11]，并在宮頸癌中過表達[12-14]。據(jù)報道，miR-20A與宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲、轉移和順鉑耐藥有關，可以抑制IFN-γ和TNF-α的分泌，減弱NK細胞對宮頸癌細胞的殺傷作用[15-19]。有關miR-106B的研究表明，其過度表達可顯著促進宮頸癌細胞系HeLa和SiHa的遷移[12]。miR-17-5P也被報道可以增強宮頸癌的增殖和轉移[20]。

綜上所述，ATAD2、SMC4和POLQ都是具有ATPase活性的基因，并且都與細胞的基因組調控有關，其失調將導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；而且三者作為宮頸癌進展過程中的DEG，既是PPI網絡中互相關聯(lián)的樞紐基因，又同時受DEM——miR-20A、miR-20B、miR-106B和miR-17-5P的調控。這是首次通過生物信息學分析正常宮頸上皮-CIN-宮頸癌進展過程中的差異表達基因的研究，并通過一系列綜合分析得出，miR-20A、miR-20B、miR-106B和miR-17-5P共同調控下的基因ATAD2、SMC4和POLQ，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中很可能發(fā)揮著至關重要的作用，并有可能用作宮頸癌的臨床分子標志物及治療靶點。但由于本研究的樣本量尤其是miRNA樣本量相對較小，所以可能具有一定的局限性，且部分研究結果尚需進一步的臨床及基礎實驗證實。