趙冉，武燕潔，劉振鳳，馮圣鋆，蘭蓓

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津 300070）

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，因此對(duì)肝癌中異常表達(dá)基因的研究將有助于尋找新的治療靶點(diǎn)。JMJD6蛋白屬于Jumonji C domain-contai ning（JMJD）蛋白家族，主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，具有催化組蛋白或非組蛋白賴氨酸羥基化和精氨酸去甲基化活性。最新研究發(fā)現(xiàn)，JMJD6還具有酪氨酸激酶活性[1]。JMJD6在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，能夠?qū)⒔M蛋白H4R3me2去甲基化[2]，并通過(guò)與Br d4結(jié)合調(diào)控轉(zhuǎn)錄[3]。JMJD6能夠與剪接因子U2AF65結(jié)合并羥基化其第15位和第276位賴氨酸，進(jìn)而影響RNA剪接[4]。此外，JMJD6能夠磷酸化組蛋白H2A.X第39位酪氨酸，促進(jìn)細(xì)胞自噬[1]。同時(shí)，越來(lái)越多的研究表明，JMJD6在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤等多種癌癥中發(fā)揮作用[5-9]，但是其在肝癌中的作用仍有待進(jìn)一步研究。為了探討JMJD6在肝癌中的作用，筆者對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，分析JMJD6在肝癌組織中的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步分析JMJD6表達(dá)對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響，為其作為肝癌診斷和治療的靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集及患者分組從GDC（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載TCGA肝癌患者項(xiàng)目為TCGALIHC的RNA FPKM數(shù)據(jù)和患者臨床資料。剔除缺少RNA數(shù)據(jù)或臨床信息的患者，且相同患者保留原位癌數(shù)據(jù)，最后371例肝癌患者列入本次分析（其中50例患者包括癌組織和正常組織，其余321例僅包括癌組織）。以肝癌組織中JMJD6 mRNA表達(dá)量中位值為界（MEDIA=3.380），將患者分為高表達(dá)組（185例）和低表達(dá)組（186例）。JMJD6在正常組織和肝癌組織中的免疫組化數(shù)據(jù)來(lái)自The Human Protein Atlas（HPA：https：//www.proteinatlas.org/）。

1.2 JMJD6表達(dá)的差異分析及與患者臨床特征的關(guān)系比較肝癌患者正常組織和腫瘤組織中的JMJD6表達(dá)量差異，以及不同臨床分期或病理分級(jí)患者之間的表達(dá)差異，尋找JMJD6表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性。進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析及Cox回歸分析，探討JMJD6表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。其中Kaplan-Meier生存分析刪除了1例無(wú)生存數(shù)據(jù)病例，Cox回歸分析中刪除27例臨床信息不全的病例。

1.3 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）利用GSEA 4.0.1對(duì)腫瘤樣本JMJD6高表達(dá)組和低表達(dá)組的差異表達(dá)基因進(jìn)行比較分析，探討JMJD6表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響。基因集數(shù)據(jù)庫(kù)選擇kegg.v7.4，置換次數(shù)設(shè)定為1 000次，以q<0.05為顯著富集基因集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用R語(yǔ)言R-4.0.3進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（P25，P75）描述，進(jìn)行Wilcoxon檢驗(yàn)比較JMJD6表達(dá)差異，進(jìn)行單因素Logistic回歸分析JMJD6表達(dá)量與臨床特征的相關(guān)性。繪制Kaplan-Meier生存分析曲線，進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JMJD6在肝癌組織中的表達(dá)腫瘤組織中JMJD6 mRNA表達(dá)顯著升高[腫瘤組織：3.380（2.489，4.969），正常組織：1.606（1.283，2.322），W=2 506，P＜0.001，圖1A]。此外，將50個(gè)正常組織及其對(duì)應(yīng)的腫瘤組織進(jìn)行配對(duì)分析，結(jié)果同樣顯示，腫瘤組織中JMJD6表達(dá)高于正常組織（配對(duì)樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)，W=87，P＜0.001，圖1B）。在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中，JMJD6免疫組化染色結(jié)果也證明了其在肝癌組織中高表達(dá)（圖1C）。

圖1 JMJD6在正常組織和肝癌組織中的表達(dá)情況Fig 1 The expression of JMJD6 in normal tissues and HCC tissues

2.2 JMJD6表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系應(yīng)用患者的臨床數(shù)據(jù)分析JMJD6與臨床分期及病理分級(jí)的關(guān)系。結(jié)果顯示，與stageⅠ期患者相比，stageⅡ、Ⅲ期患者JMJD6表達(dá)水平升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[stageⅠ：3.093（2.341，4.060），stageⅡ：3.845（2.979，6.220），stageⅢ：4.112（2.526，5.640），stageⅡvs.stageⅠ：W=5 041，P<0.001，stageⅢvs.stageⅠ，W=5 543，P<0.01，圖2A]。同樣，與G1級(jí)相比，G3、G4級(jí)患者JMJD6表達(dá)水平也升高[G1：2.844（2.012，4.237），G2：3.089（2.415，4.373），G3：3.987（3.050，6.105），G4：4.386（3.433，5.355），G3 vs.G1：W=2 140，P<0.001，G4 vs.G1：W=185，P<0.05，圖2B]。采用單因素Logistic回歸分析JMJD6表達(dá)與不同臨床病理特征之間的關(guān)系，JMJD6高表達(dá)與病理分級(jí)和臨床分期呈正相關(guān)，與年齡呈負(fù)相關(guān)，而與性別無(wú)關(guān)（表1）。

表1 JMJD6基因表達(dá)水平與肝癌患者臨床特征的關(guān)系Tab 1 Relationship between JMJD6 gene expression level and clinical indicators in patients with HCC

圖2 JMJD6 mRNA表達(dá)量與臨床分期、病理分級(jí)的關(guān)系Fig 2 The relationship between the expression of JMJD6 mRNA and clinical stage/pathological grade

2.3 JMJD6表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系為了研究JMJD6表達(dá)與腫瘤患者生存率之間的關(guān)系，進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。結(jié)果顯示，JMJD6高表達(dá)患者中位生存期為4.082年，少于低表達(dá)患者的5.838年（χ2=5.541，P<0.05，圖3A）。Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，JMJD6高表達(dá)患者和低表達(dá)患者的中位生存期分別為41個(gè)月和81.9個(gè)月（P<0.001，圖3B）。

圖3 JMJD6 mRNA表達(dá)量對(duì)肝癌患者生存率的影響Fig 3 The effect of JMJD6 mRNA expression on survival rate of patients of HCC

采用單因素Cox回歸分析年齡、性別、病理分級(jí)、臨床分期、飲酒、Hepatitis B或Hepatitis C感染與否、吸煙及JMJD6表達(dá)量對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響。結(jié)果顯示，臨床分期、Hepatitis C感染和JMJD6表達(dá)量與肝癌患者預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素回歸分析中，與臨床分期stageⅠ患者相比，stageⅢ和Ⅳ患者死亡風(fēng)險(xiǎn)升高（HR=2.292，95%CI：1.469~3.575，P＜0.001；HR=8.202，95%CI：2.484~27.079，P＜0.001）；丙型肝炎病毒感染及JMJD6高表達(dá)患者死亡風(fēng)險(xiǎn)也升高（HR=2.115，95%CI：1.426~3.139，P＜0.001；HR=1.109，95%CI：1.039~1.184，P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 肝癌患者總生存率的單因素和多因素Cox回歸分析Tab 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of overall survival rate in patients with HCC

2.4 JMJD6表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響通過(guò)GSEA分析，探討JMJD6表達(dá)所影響的信號(hào)通路。JMJD6高表達(dá)組中，前5個(gè)富集的基因集包括：核糖體、剪接、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期。JMJD6低表達(dá)組中，前10個(gè)富集的基因集包括：脂肪酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、色氨酸代謝等（圖4）。

圖4 GSEA分析JMJD6表達(dá)對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響Fig 4 GSEA analysis of the effect of JMJD6 expression on cell signaling pathway

3 討論

肝癌是常見(jiàn)的癌癥類型之一，其發(fā)生與多種因素有關(guān)，其中以慢性乙型肝炎病毒感染和肝硬化最為常見(jiàn)。肝癌的治療方法包括肝移植、肝切除、消融、化療栓塞，靶向治療肝癌的一線藥物包括索拉非尼等，但是肝癌的治療效果仍然不令人滿意[10]。因此，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中異常表達(dá)的蛋白并確定其作用機(jī)制，將為肝癌的診療提供新的作用靶點(diǎn)。

JMJD6能夠催化賴氨酸羥基化和精氨酸去甲基化，其底物包括組蛋白和多種非組蛋白。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，JMJD6在多種癌癥中異常表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。其機(jī)制包括：在結(jié)腸癌中，JMJD6結(jié)合并羥基化p53的K382，抑制了p53的轉(zhuǎn)錄活性[11]；在乳腺癌中，JMJD6能夠抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β通路[5]，且JMJD6在雌激素受體α結(jié)合的增強(qiáng)子的募集是RNA聚合酶Ⅱ招募和增強(qiáng)子RNA產(chǎn)生所必需的，因此雌二醇引起的乳腺癌細(xì)胞增殖依賴于JMJD6[12]。

在本研究中，筆者利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)在肝癌患者的癌癥組織中JMJD6 mRNA表達(dá)量高于正常組織，且隨著癌癥患者分期增加或者病理分級(jí)增加，JMJD6表達(dá)也升高。其中，stageⅣ患者與stageⅠ患者相比，JMJD6表達(dá)無(wú)明顯差別（P>0.05），原因可能在于stageⅣ僅為5例，樣本量過(guò)小，不具有代表性。單因素Logistic回歸分析顯示JMJD6高表達(dá)與年齡、臨床分期和病理分級(jí)相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明JMJD6 mRNA高表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。其次，Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果表明，JMJD6 mRNA高表達(dá)導(dǎo)致肝癌患者生存率下降，Cox回歸分析顯示JMJD6表達(dá)量、臨床分期及丙型肝炎病毒感染是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，即JMJD6高表達(dá)導(dǎo)致了肝癌患者的不良預(yù)后。

GSEA分析結(jié)果顯示，JMJD6高表達(dá)組在RNA剪接、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期等通路富集。RNA剪接是JMJD6已知重要功能之一，在黑色素瘤中，JMJD6通過(guò)影響p21-Activated kinase 1（PAK1）的可變剪接，激活絲裂原活化蛋白激酶通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲[8]；細(xì)胞周期的失調(diào)是腫瘤細(xì)胞異常增殖的基礎(chǔ)[13]，JMJD6高表達(dá)伴隨細(xì)胞周期通路基因的富集，如Cyclin B1（CCNB1）、Cyclin B1（CCNB2）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2（CDK2）的高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)[14]。此外，JMJD6高表達(dá)組在DNA復(fù)制通路富集，包括在DNA復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用的MCM蛋白。而根據(jù)之前的報(bào)道，MCM家族蛋白能夠促進(jìn)肝癌的增殖[15]。JMJD6低表達(dá)組在脂肪酸和氨基酸代謝通路富集，而JMJD6在腫瘤代謝中的研究還未見(jiàn)報(bào)道，該結(jié)果提示JMJD6在代謝過(guò)程可能也發(fā)揮作用。

筆者還分析了JMJD6在肝癌患者中的突變和拷貝數(shù)改變的情況（結(jié)果未展示）。在已知信息的364例患者中，僅有1例患者JMJD6基因發(fā)生突變，說(shuō)明JMJD6在肝癌患者中的突變頻率很低。JMJD6不屬于拷貝數(shù)顯著擴(kuò)增或缺失基因，因此JMJD6突變及拷貝數(shù)變化不是導(dǎo)致其在腫瘤中表達(dá)升高的原因。

總之，本研究結(jié)果說(shuō)明JMJD6在肝癌組織中高表達(dá)，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及患者不良預(yù)后相關(guān)，為后續(xù)研究鑒定了基礎(chǔ)。