高雅，趙洋，朱香熹，趙玉龍，李光明，楊吉龍，葉帥，朱澤

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，天津 300070；2.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)臨床醫(yī)學(xué)系，珠海 519090；3.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，天津 300060；4.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院護(hù)理部，天津 300050）

惡性周圍神經(jīng)鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一種源于外周神經(jīng)分支或鞘膜的惡性軟組織肉瘤，約占軟組織惡性肉瘤的10%，其中50%的MPNST患者是在Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 1，NF1）的背景下發(fā)展而來(lái)的。MPNST對(duì)放療和化療都具有抵抗性，敏感性相對(duì)較低，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，現(xiàn)有的治療方式都存在一定的局限性，往往預(yù)后較差，死亡率較高[1-2]。隨著分子靶向研究和臨床試驗(yàn)的不斷發(fā)展，為其治療帶來(lái)新的突破。國(guó)內(nèi)外研究顯示，多梳抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex，PRC2）對(duì)組蛋白3上的第27位賴氨酸的三甲基化（trimethylation of lysine 27 on histone3，H3K27me3）這一表觀遺傳標(biāo)志物具有一定的調(diào)控作用，其缺失在MPNST的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。PRC2組分的缺失突變與異常的H3K27me3表達(dá)水平在不同腫瘤中都有所體現(xiàn)，也被認(rèn)為是預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)和致癌驅(qū)動(dòng)因素[4]。

本課題組前期研究顯示，Harvery鼠肉瘤病毒基因Ras及其下游MEK-ERK絲裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)通路在MPNST中異?；钴S[5]。相關(guān)報(bào)道顯示，與NF1相關(guān)的MPNST中PRC2核心組分Zeste12抑制因子（suppressor of zeste 12，SUZ12）的丟失可放大Ras的激活效應(yīng)[6]。因此，本研究選擇該通路相關(guān)的抑制劑司美替尼作為切入點(diǎn)進(jìn)行研究。司美替尼作為一種非ATP競(jìng)爭(zhēng)性和高效選擇性的MEK1/2抑制劑，在多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究中都顯示其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能力具有抑制作用[7]。因此，本研究旨在通過(guò)觀察司美替尼對(duì)MPNST細(xì)胞增殖、凋亡等的影響，探討可能存在的分子機(jī)制，為抗腫瘤治療提供更多的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器人MPNST細(xì)胞株ST88-14、STS26T由天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院楊吉龍教授饋贈(zèng)；Selumetinib（AZD6244）購(gòu)自MedChemExpress公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自新賽美有限公司；SUZ12、EZH2、EED引物合成于金唯智有限公司；H3K27me3抗體購(gòu)自Abcam公司；beta Actin抗體購(gòu)自Abways公司；MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2及p-ERK1/2抗體購(gòu)自Wanleibio公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosyst公司；電泳儀和凝膠成像分析儀購(gòu)自BIORAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) STS26T、ST88-14均采用含1%青鏈霉素混合液和10%胎牛血清培養(yǎng)基，37℃、7.5%CO2培養(yǎng)。

1.2.2 藥物稀釋 50 mg司美替尼溶于DMSO中，配制成10 mmol/L儲(chǔ)存液，于細(xì)胞培養(yǎng)液中稀釋至實(shí)驗(yàn)所需終濃度。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組（0.1%DMSO）；不同濃度司美替尼給藥組（0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μmol/L）。每孔約10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，24 h后加入不同濃度的抑制劑。48 h后每孔加入10μL CCK-8試劑，孵育2 h，測(cè)定450 nm處各孔吸光度值，繪制IC50曲線。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組；司美替尼給藥組：根據(jù)半數(shù)抑制濃度分別處理ST88-14、STS26T。6孔板每孔接種約500個(gè)細(xì)胞，30%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，司美替尼給藥組加入半數(shù)抑制濃度抑制劑，持續(xù)培養(yǎng)兩周。去除培養(yǎng)液，PBS清洗，4%的多聚甲醛固定。然后加入結(jié)晶紫染液，常溫放置10 min，PBS洗后拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。6孔板底部每隔約1 cm畫(huà)一條直線，每孔穿過(guò)3條橫線，劃痕與橫線的交叉點(diǎn)為觀察點(diǎn)。每孔接種約40萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)。用200μL槍頭垂直板底橫線劃痕，加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)液。司美替尼給藥組加半數(shù)抑制濃度的抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)，拍照記錄0、3、6、12、24 h細(xì)胞遷移情況。

1.2.6 Transwell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。Matrigel膠用DMEM培養(yǎng)液1∶8進(jìn)行稀釋，以每孔45μL鋪于侵襲組上室底部，遷移組不加。待Matrigel膠凝固成膜。司美替尼給藥組上室每孔加入250μL含3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞且加有抑制劑的DMEM細(xì)胞懸液，下室加入750μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)液。48 h后擦去上室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染液染色10 min，拍照，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù) 實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組（0.1%DMSO）；不同濃度司美替尼給藥組（5、10、20μmol/L）。采用Annexin V-FITC/PI雙染法進(jìn)行檢測(cè)。用不含EDTA胰酶消化收集細(xì)胞，將其保存在含2%BSA的PBS緩沖液中。PBS洗2~3次，每次2 000×g離心5 min。每個(gè)樣品加入500μL Binding Buffer重懸細(xì)胞。染料瞬離5 s，分別加入單染管5μL。每組樣品加5μL Annexin V-FITC，再加5μL PI，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。最后用Flow Jo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。ST88-14、STS26T接種于6孔板，37℃培養(yǎng)24 h后司美替尼給藥組加入半數(shù)抑制濃度抑制劑，對(duì)照組不加抑制劑。加藥后分別于6、12、24、48 h，收取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每孔加入500μLTrizol冰上裂解，提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行RTqPCR檢測(cè)。

1.2.9 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.7。RIPA和PMSF以100∶1濃度配置細(xì)胞裂解液，每孔加入200μL。裂解完全后收集于離心管中，4℃，14 000×g，5 min。取上清測(cè)定濃度，進(jìn)行等質(zhì)量蛋白電泳，然后300 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min，封閉2 h。一抗：MEK（1∶500）、p-MEK（1∶300）、ERK（1∶500）、p-ERK（1∶300）、H3K27me3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）4℃搖床過(guò)夜孵育，二抗（1∶3 000）室溫?fù)u床孵育2 h，顯色，曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 8.0和Flow Jo-V10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析，P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 司美替尼對(duì)ST88-14和STS26T細(xì)胞半數(shù)抑制濃度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于ST88-14細(xì)胞，司美替尼的半數(shù)抑制濃度為13.58μmol/L；對(duì)于STS26T細(xì)胞，司美替尼的半數(shù)抑制濃度為17.60 μmol/L（圖1）。

圖1 司美替尼對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig 1 Effect of selumetinib on cell viability

2.2 司美替尼對(duì)MPNST細(xì)胞系增殖能力的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ST88-14細(xì)胞給藥組克隆數(shù)量減少41.4%（t=16.44，P<0.05）；STS26T減少30.4%（t=16.21，P<0.05）。與對(duì)照組相比，給藥組形成更少且更小的細(xì)胞集落，見(jiàn)圖2。

圖2 司美替尼對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響Fig 2 Effect of selumetinib on cell proliferation

2.3 司美替尼對(duì)MPNST細(xì)胞系遷移、侵襲能力的作用結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，給藥組兩種細(xì)胞系的遷移率均逐漸降低。ST88-14細(xì)胞24 h總遷移率降低49.3%（t=13.98，P<0.05），STS26T細(xì)胞降低41.4%（t=14.4，P<0.05）（圖3A、B）。經(jīng)藥物作用48 h，兩種細(xì)胞的遷移和侵襲能力均降低。ST88-14細(xì)胞遷移率降低31.9%（t=4.02，P<0.05），侵襲率降低了31.3%（t=10.51，P<0.05）；STS26T細(xì)胞遷移率降低31.8%（t=2.21，P<0.05），侵襲率降低了32.0%（t=8.44，P<0.05）（圖3C、D）。

圖3 司美替尼對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響Fig 3 Effect of selumetinib on cell migration and invasion

2.4 司美替尼對(duì)MPNST細(xì)胞凋亡的作用司美替尼作用48 h細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示（圖4），與對(duì)照組相比，ST88-14和STS26T 10μmol/L和20μmol/L司美替尼給藥組細(xì)胞凋亡差異具有統(tǒng)計(jì)意義（t=14.64、10.10，均P<0.05；t=3.06、13.10，均P<0.05）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況Fig 4 Flow cytometry for detection of apoptotic cells

2.5 司美替尼對(duì)PRC2各組分mRNA表達(dá)水平的影響結(jié)果顯示，與各自的對(duì)照組相比，ST88-14司美替尼（13.58μmol/L）給藥組和STS26T司美替尼（17.60μmol/L）給藥組PRC2核心組分SUZ12和EZH2的表達(dá)水平在24 h（t=14.30、6.53，均P<0.05；t=4.13、4.70，均P<0.05）和48 h（t=13.39、16.84，均P<0.05；t=6.10、12.93，均P<0.05）均顯著升高（圖5）。

圖5 司美替尼處理不同時(shí)間PRC2各組分mRNA表達(dá)水平Fig 5 mRNA expression levels of PRC2 components in different time of selumetinib treatment

2.6 司美替尼對(duì)H3K27me3表達(dá)的作用與對(duì)照組相比，ST88-14和STS26T細(xì)胞20μmol/L司美替尼給藥組MEK1/2（t=8.76、6.59，均P<0.05）、ERK1/2（t=6.02、4.82，均P<0.05）磷酸化水平均顯著降低且H3K27me3表達(dá)水平均顯著升高（t=12.82、18.78，均P<0.05）（圖6）。

圖6 司美替尼對(duì)H3K27me3表達(dá)水平的影響Fig 6 Effect of selumetinib on the expression of H3K27me3

3 討論

隨著抗腫瘤治療的深入研究，RAS-RAF-MEKERK已經(jīng)成為一條非常經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注，且在多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制中都有所體現(xiàn)。該通路存在于多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，通過(guò)上下游關(guān)系對(duì)細(xì)胞的周期、增殖和遷移等多種生理功能進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而在腫瘤發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮作用[8]。因此，該通路靶向抑制劑研制也備受關(guān)注。司美替尼作為一種MEK1/2抑制劑在許多實(shí)體瘤中進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，表現(xiàn)出可觀的安全性和有效性。在其他臨床前研究中，司美替尼也顯示出抗黑色素瘤、結(jié)直腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌等的活性[9-10]。國(guó)外臨床研究數(shù)據(jù)顯示，在一項(xiàng)Ras途徑突變卵巢癌臨床試驗(yàn)中，15%的患者對(duì)治療表現(xiàn)出客觀反應(yīng)，65%的患者病情趨于穩(wěn)定，表現(xiàn)出良好的耐受性[11]。2020年，司美替尼單克隆抗體（Koselugo）在美國(guó)上市且被評(píng)為孤兒藥地位和突破性療法，臨床試驗(yàn)也在不斷進(jìn)行當(dāng)中[12-13]。本課題組前期研究也顯示，在51例MPNST樣本中存在該通路的過(guò)度激活[5]，說(shuō)明該通路的異常表達(dá)與MPNST的演進(jìn)存在一定的聯(lián)系。因此，筆者提出假設(shè)MEK1/2抑制劑司美替尼也有可能在MPNST治療中發(fā)揮一定作用。

MPNST由于其罕見(jiàn)的表現(xiàn)形式和相對(duì)有限的治療手段，使其在臨床治療上面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。隨著分子靶向技術(shù)和轉(zhuǎn)化研究的不斷深入，也為該疾病在治療上找到新的突破。2019年國(guó)內(nèi)發(fā)布的病理學(xué)檢測(cè)專家共識(shí)中也提出了可將H3K27me3作為MPNST的免疫組織化學(xué)標(biāo)記檢測(cè)分子指標(biāo)[14]。基因表達(dá)調(diào)控是在蛋白翻譯后修飾上進(jìn)行的，H3K27me3作為抑制基因轉(zhuǎn)錄的重要表觀遺傳標(biāo)志物，其由PRC2復(fù)合蛋白進(jìn)行調(diào)控。PRC2的核心成分由有催化活性的SUZ12、Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）和負(fù)責(zé)變構(gòu)激活的胚胎外胚層發(fā)育基因（embryonic ectoderm development，EED）組成[15]。國(guó)外有大量研究顯示，H3K27me3丟失的MPNST患者在基因測(cè)序中發(fā)現(xiàn)多數(shù)伴隨著SUZ12和EED的缺失突變[16-17]。課題組前期通過(guò)組織芯片技術(shù)對(duì)43例MPNST患者病理標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)H3K27me3在65.11%的標(biāo)本中存在不同程度的缺失[18]。由此可見(jiàn)，H3K27me3對(duì)MPNST的表觀遺傳調(diào)控及其調(diào)控元件在MPNST發(fā)病和演進(jìn)中發(fā)揮著重要作用。

本研究通過(guò)觀察司美替尼對(duì)MPNST細(xì)胞系的影響，探討可能存在的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，司美替尼抑制MPNST細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，且對(duì)細(xì)胞的侵襲和遷移產(chǎn)生了相應(yīng)的抑制效果。ST88-14和STS26T細(xì)胞經(jīng)司美替尼處理后，MEK1/2和ERK1/2蛋白磷酸化水平逐漸降低，MEK-ERK通路受到抑制，H3K27me3表達(dá)水平升高。因此，筆者得出結(jié)論司美替尼可通過(guò)促進(jìn)H3K27me3的表達(dá)抑制MPNST細(xì)胞ST88-14和STS26T的增殖，促進(jìn)其凋亡。隨著藥物作用時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，PRC2各組分顯示不同程度的變化，24 h和48 h給藥組SUZ12和EZH2顯著升高，EED沒(méi)有差異性變化。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究都顯示MPNST中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)EZH2的顯著缺失[2]，但是筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著H3K27me3的上調(diào)，不僅SUZ12顯著升高，EZH2也顯著升高，說(shuō)明PRC2各組分對(duì)于MPNST的調(diào)控作用相對(duì)復(fù)雜，不是單純的正反饋或負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，可能存在某種補(bǔ)償效應(yīng)，需通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究在證明司美替尼對(duì)MPNST細(xì)胞ST88-14和STS26T增殖抑制的同時(shí)，進(jìn)一步證實(shí)了PRC2核心組分對(duì)H3K27me3表達(dá)存在一定的調(diào)控作用且H3K27me3在MPNST發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。這將有助于揭示MPNST的發(fā)病機(jī)制，為抗腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。