王鳳松，朱劉洋，白易，張雅敏

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 300192；2.天津市第一中心醫(yī)院肝膽外科，天津 300192）

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要病理類型，占85%～90%，5年生存率僅為12%，這也與大多數(shù)患者確診時已處于晚期有關(guān)[1]。目前，臨床醫(yī)生可以根據(jù)病理分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床信息預(yù)測HCC患者預(yù)后，但預(yù)測能力有限[2]。因此，進(jìn)一步探索新的生物標(biāo)志物對判斷HCC患者預(yù)后和選擇治療方案具有重要意義。

近年來，隨著針對HCC晚期患者的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIS）的開發(fā)，其治療策略發(fā)生了革命性的變化[3]。腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden，TMB）和程序性死亡配體-1（PD-L1）的表達(dá)已逐漸成為多種腫瘤免疫檢查點(diǎn)選擇的最佳生物標(biāo)志物，包括肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和乳腺癌[4]。本研究從腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫下載多組學(xué)數(shù)據(jù)，探討TMB水平與HCC預(yù)后的關(guān)系，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法篩選出3個與TMB相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因，建立風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型。作為獨(dú)立的預(yù)后因素，該預(yù)后模型為判斷肝癌患者的預(yù)后和治療方案的選擇提供了一種新的工具，具有潛在臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與處理從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載截至2020年12月1日的HCC患者的多組學(xué)數(shù)據(jù)（刪除病理類型為非HCC的樣本），包括364例HCC組織和49例正常肝組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)（Illumina HiSeq RNA-Seq平臺）、354例體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)和367例患者臨床資料。對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋（http：//asia.ensembl.org/homo_sapiens/info/index），重復(fù)的基因計(jì)算表達(dá)量平均值，所有基因表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2（基因表達(dá)值+1）轉(zhuǎn)換用于后續(xù)分析。

1.2 基因突變圖譜及腫瘤突變負(fù)荷通過“maftools”R包[5]繪制HCC患者基因突變圖譜。運(yùn)用Perl軟件確定每個樣本的基因突變總數(shù)以計(jì)算TMB，基因突變包括堿基置換、編碼移位、插入和缺失等。根據(jù)X-Tile軟件（版本3.6.1）[6]產(chǎn)生的最佳截止值，將HCC樣本分為高TMB組（n=279）和低TMB組（n=69）。Kapla n-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)分析TMB水平與HCC患者總體生存率的關(guān)系。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)分析TMB水平與HCC患者臨床特征的相關(guān)性，包括年齡、性別、體重指數(shù)（BMI）、T分期、M分期、N分期、病理分期、腫瘤分級及乙肝病毒感染。

1.3 構(gòu)建并驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型將每個樣本TMB數(shù)據(jù)與基因表達(dá)數(shù)據(jù)合并，利用“edgeR”R包[7]，分析得到高、低TMB組之間差異表達(dá)基因及肝癌組織、癌旁組織之間差異表達(dá)基因（|Log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.01），兩組差異表達(dá)基因取交集得到TMB相關(guān)差異表達(dá)基因。合并基因表達(dá)數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)，將355個肝癌樣本隨機(jī)平均分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。根據(jù)X-Tile軟件產(chǎn)生的最佳截止值，在訓(xùn)練集中對交集差異表達(dá)基因進(jìn)行批量生存分析，篩選P<0.01（Log-rank檢驗(yàn)）的基因?yàn)轭A(yù)后相關(guān)差異表達(dá)基因以進(jìn)一步分析。通過LASSO（least absolute shrinkage and selection operator，1 000次重復(fù)中出現(xiàn)>950次）及多元回歸分析確定模型基因及風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)。TMB相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型構(gòu)建如下：風(fēng)險(xiǎn)評分=∑（風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)*基因的表達(dá)量）。計(jì)算訓(xùn)練集中每個樣本的風(fēng)險(xiǎn)評分，由X-Tile軟件確定的最佳截止值以分成高、低風(fēng)險(xiǎn)組，繪制風(fēng)險(xiǎn)評分的生存曲線，并通過受試者特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）評估風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型的預(yù)測性能。此外，在驗(yàn)證集中驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型的預(yù)測能力。

1.4 獨(dú)立預(yù)后因素分析為評估HCC風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型臨床預(yù)測能力，將風(fēng)險(xiǎn)評分與其他臨床特征（年齡、性別、BMI、病理分期、腫瘤分級和乙肝病毒感染）進(jìn)行單因素和多因素分析。其中，單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量被納入多因素分析以確定獨(dú)立預(yù)后因素。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R軟件（版本3.6.0）及SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者基因突變圖譜TCGA數(shù)據(jù)庫354例HCC患者基因突變圖譜中，327例（92.7%）具有基因突變（圖1A），所有HCC樣本基因突變量的中位值為71。其中最常見的基因突變類型是錯義突變，但在某些基因中錯義突變比例較小，如AXIN1和RB1。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是最常見的變異類型，C>T、T>C和C>A是最常見的SNP。HCC中最常見的突變基因是TP53（30%）、TTN（24%）、CTNNB1（25%），見圖1B。

圖1 HCC患者基因突變圖譜Fig 1 Gene mutation profiles of patients with HCC

2.2 TMB與預(yù)后和臨床特征有關(guān)計(jì)算得到HCC患者TMB，合并TMB數(shù)據(jù)和臨床信息得到348個HCC樣本（刪除6個生存天數(shù)為0及缺乏生存信息的樣本）。根據(jù)X-tile得到的最佳截止值（TMB=1.895），將所有樣本分為兩組，其中高TMB組有279個樣本，低TMB組有69個樣本。Kaplan-Meier分析表明低TMB組的HCC患者總體生存率較高（χ2=6.632，P=0.01），見圖2。對TMB水平與臨床特征的關(guān)系分析顯示，較高的TMB水平與高齡（χ2=10.328，P=0.001 7）、男性（χ2=9.384，P=0.002 9）和N0分期（χ2=4.723，P=0.03）有關(guān)（圖3）。

圖2 TMB水平與HCC患者總體生存率之間的關(guān)系Fig 2 Relationship between TMB level and overall survival of patients with HCC

圖3 TMB水平與HCC患者臨床特征的關(guān)系Fig 3 Relationship between TMB level and clinical characteristics of patients with HCC

2.3 TMB相關(guān)差異表達(dá)基因合并HCC患者TMB數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，高、低TMB組差異表達(dá)分析得到690個差異表達(dá)基因。其中在高TMB組，282個基因表達(dá)上調(diào)，408個基因表達(dá)下調(diào)。對364個HCC組織和49個癌旁組織進(jìn)行差異表達(dá)分析得到8 562個差異表達(dá)基因，在HCC組織中有6 943個基因表達(dá)上調(diào)和1 619個基因表達(dá)下調(diào)。兩組差異表達(dá)基因取交集，共有457個與TMB相關(guān)的差異表達(dá)基因。

2.4 構(gòu)建并驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型將基因表達(dá)數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)合并得到355個樣本，按照1∶1的比例隨機(jī)分組，其中訓(xùn)練集有177個樣本，驗(yàn)證集有178個樣本。在訓(xùn)練集中，457個TMB相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行批量生存分析顯示，62個基因與HCC患者預(yù)后顯著相關(guān)（均P<0.01）。對62個基因進(jìn)行LASSO分析得到風(fēng)險(xiǎn)基因?yàn)镕ABP6、PFKP和PROK1，多元回歸分析得到3個基因的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)分別為0.132 08、0.153 83和-0.180 47。風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型構(gòu)建如下：風(fēng)險(xiǎn)評分=（0.13208×FABP6表達(dá)量）+（0.153 83×PFKP表達(dá)量）+（-0.18047×PROK1表達(dá)量）。計(jì)算訓(xùn)練集中每個樣本的風(fēng)險(xiǎn)評分，根據(jù)Xtile軟件生成的最佳截止值，高風(fēng)險(xiǎn)組有49個樣本，低風(fēng)險(xiǎn)組有128個樣本。Kaplan-Meier分析顯示低風(fēng)險(xiǎn)組HCC患者總體生存率較高（χ2=66.725，P<0.000 1，圖4B），且3個模型基因均與預(yù)后顯著相關(guān)（圖4A）。ROC顯示，該模型在1年、3年及5年的AUC分別為0.764、0.707、0.716，表現(xiàn)出良好的預(yù)后能力（圖4C）。

圖4 訓(xùn)練集中構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型Fig 4 Construction of risk score prognostic model in training set

在驗(yàn)證集中，根據(jù)已建立的模型計(jì)算178個樣本的風(fēng)險(xiǎn)評分，其中高風(fēng)險(xiǎn)組有46個樣本，低風(fēng)險(xiǎn)組有132個樣本。與訓(xùn)練集結(jié)果一致，Kaplan-Meier分析顯示低風(fēng)險(xiǎn)組HCC患者總體生存率較高（χ2=38.364，P<0.000 1，圖5），且3個模型基因均與HCC患者預(yù)后相關(guān)。驗(yàn)證集中ROC曲線顯示，該模型在1年、3年及5年的AUC分別為0.682、0.689、0.724。

圖5 驗(yàn)證集中驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型Fig 5 Construction of risk score prognostic model in validation set

2.5 單因素及多因素分析預(yù)后影響因素將風(fēng)險(xiǎn)評分、年齡、性別、BMI、病理分期、腫瘤分級和病毒感染狀態(tài)納入單因素分析，其中風(fēng)險(xiǎn)評分（HR＝2.252，95%CI：1.520～3.337，P<0.001）、病理分期（HR＝1.732，95%CI：1.400～2.143，P<0.001）及病毒狀態(tài)（HR＝0.488，95%CI：0.320～0.743，P<0.001）與HCC預(yù)后顯著相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評分（HR＝2.016，95%CI：1.356～2.997，P<0.001）及病理分期（HR＝1.591，95%CI：1.274～1.987，P<0.001）為獨(dú)立預(yù)后因素（圖6）。

圖6 風(fēng)險(xiǎn)評分及臨床特征對HCC患者預(yù)后影響的單因素及多因素分析Fig 6 Univariate and multivariate analysis of the influence of risk score and clinical characteristics on the prognosis of patients with HCC

3 討論

由于其復(fù)雜的分子機(jī)制和細(xì)胞異質(zhì)性，HCC是我國致死率較高的惡性腫瘤之一[8]。盡管在免疫治療及靶向治療方面取得了巨大進(jìn)展，晚期HCC患者的預(yù)后仍然較差。HCC患者的常見臨床信息對判斷預(yù)后具有一定的意義，但其預(yù)測能力有限。因此，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物對更加準(zhǔn)確預(yù)測HCC患者預(yù)后具有重要臨床意義，有助于指導(dǎo)治療方案的選擇。

通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC樣本分析發(fā)現(xiàn)，低TMB的患者預(yù)后較好。作為一種新的生物標(biāo)志物，TMB與免疫抑制劑對非小細(xì)胞肺癌和惡性黑色素瘤的治療效果有關(guān)[9]。有研究證實(shí)，在非小細(xì)胞肺癌和惡性黑色素瘤中，高TMB的患者具有更好的預(yù)后，而在腎透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中則相反[10]。有研究表明，高TMB促進(jìn)了自然殺傷（NK）細(xì)胞的激活，NK細(xì)胞通過分泌血小板衍生因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，促進(jìn)血管生成和腫瘤進(jìn)展[11-12]。另外，由NK細(xì)胞分泌的干擾素-γ增加了腫瘤細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)，并抑制免疫應(yīng)答，導(dǎo)致HCC患者預(yù)后較差，但其具體機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究[13-14]。

本研究通過生物信息學(xué)方法篩選出3個風(fēng)險(xiǎn)基因（FABP6、PFKP和PROK1），其中PFKP和FABP6的高表達(dá)與HCC患者預(yù)后不良有關(guān)，而PROK1可能與預(yù)后較好有關(guān)。PFKP基因編碼血小板型磷酸果糖激酶，作為糖酵解的重要調(diào)節(jié)酶，其異常表達(dá)與許多類型的腫瘤有關(guān)，包括肺癌、腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[15-17]。除了促進(jìn)腫瘤生長和增殖之外，PFKP還通過與癌基因的相互作用在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[18]。FABP6是脂肪酸結(jié)合蛋白之一，已被證明在結(jié)腸癌中的異常高表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤的快速進(jìn)展[19]。Ohata等[20]發(fā)現(xiàn)，脂肪酸結(jié)合蛋白5可以通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)HCC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，可作為HCC預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。Monnier等[21]發(fā)現(xiàn)，在HCC中PROK1具有抑制血管生成的效果，從而抑制腫瘤的增殖和遷移。

黃秀紅等[22]通過篩選miRNA構(gòu)建HCC風(fēng)險(xiǎn)評分模型，預(yù)測準(zhǔn)確性均優(yōu)于TNM分期，并可作為獨(dú)立預(yù)測HCC患者預(yù)后的模型。楊雙燕等[23]基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白B2可作為肝癌潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究基于TMB，通過多組學(xué)分析識別預(yù)后生物標(biāo)志物，構(gòu)建了HCC風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型，該模型在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中均具有良好的預(yù)測能力。此外，該風(fēng)險(xiǎn)評分模型被證明是獨(dú)立預(yù)后因素，對于臨床醫(yī)生判斷患者預(yù)后和選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨赣泻艽蟮膸椭?，可?shí)現(xiàn)對HCC患者的個性化精準(zhǔn)治療。但是，本研究仍然存在很多不足，TCGA數(shù)據(jù)庫中的HCC樣本量較少且多為西方國家人群，因此有必要擴(kuò)大樣本量及納入國內(nèi)測序結(jié)果，以提高模型的預(yù)測能力。其次，本模型缺乏外部驗(yàn)證，需要在外部數(shù)據(jù)庫及臨床樣本中驗(yàn)證其預(yù)測能力。此外，3個風(fēng)險(xiǎn)基因影響HCC預(yù)后的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，其可能成為HCC治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法分析TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC樣本多組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)低TMB水平與HCC預(yù)后較好顯著相關(guān)，并基于TMB構(gòu)建了HCC風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型，該模型具有良好的預(yù)后能力，是HCC患者獨(dú)立預(yù)后因素。因此，該模型能作為新的生物標(biāo)志物判斷HCC患者預(yù)后，對治療方案的選擇具有一定的參考價值。