龔曉昕，沈苗苗，李徐梓超，向嵩

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津 300070）

準(zhǔn)確而順利的DNA復(fù)制對(duì)于細(xì)胞生存至關(guān)重要。大量的外源性和內(nèi)源性因素，例如核苷酸耗竭、DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物、DNA堿基損傷等都會(huì)對(duì)DNA復(fù)制造成壓力，從而導(dǎo)致復(fù)制停滯[1-2]。停滯的復(fù)制叉是一種非常不穩(wěn)定的DNA結(jié)構(gòu)，容易導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂和核溶解，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，最終造成細(xì)胞死亡[3-4]。細(xì)胞進(jìn)化出復(fù)雜的機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)這些復(fù)制壓力。其中，高度保守的真核生物DNA損傷耐受通路（DNA damage tolerance，DDT）通過(guò)易出錯(cuò)的跨損傷合成（translesionsynthesis，TLS）和無(wú)錯(cuò)誤的模板轉(zhuǎn)換DNA合成（template switch，TS）兩條分支來(lái)恢復(fù)被中斷的DNA復(fù)制[5-6]。解旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子（helicase-like transcription factor，HLTF）在人類細(xì)胞的DDT通路中起到關(guān)鍵作用。DDT中TLS分支與TS分支都是通過(guò)將增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）高度保守的Lys164泛素化修飾而啟動(dòng)的。泛素連接酶Rad18和泛素結(jié)合酶Rad6將該殘基單泛素化修飾，啟動(dòng)TLS分支[7]。HLTF具有泛素連接酶活性，它可進(jìn)一步使用Lys63相連接的泛素鏈標(biāo)記PCNA，啟動(dòng)無(wú)錯(cuò)誤的TS分支。這一反應(yīng)以單泛素化的PCNA為底物，還需要泛素結(jié)合酶復(fù)合物Ubc13-Mms2的共同參與[8-10]。除此之外，HLTF還能通過(guò)催化ATP水解驅(qū)動(dòng)復(fù)制叉退行[11]。在停滯的復(fù)制叉處，TS分支可通過(guò)復(fù)制叉退行實(shí)現(xiàn)；復(fù)制叉退行也能保護(hù)停滯的復(fù)制叉[2，12-13]。與HLTF在DNA復(fù)制壓力應(yīng)對(duì)中的關(guān)鍵功能一致，研究發(fā)現(xiàn)HLTF與早衰、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及多種癌癥密切相關(guān)[1，14]。

HLTF的分子量為114 kD，是一個(gè)較為復(fù)雜的多結(jié)構(gòu)域蛋白。它由HIRAN結(jié)構(gòu)域、Snf2家族的DNA解旋酶結(jié)構(gòu)域（Snf2結(jié)構(gòu)域）和嵌在其中的RING結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。Snf2結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)復(fù)制叉退行；RING結(jié)構(gòu)域編碼泛素連接酶活性；HIRAN結(jié)構(gòu)域在復(fù)制叉退行中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8，13，15-17]。本課題組近期對(duì)HLTF的酵母同源蛋白R(shí)ad5的結(jié)構(gòu)和功能研究為理解HLTF的功能機(jī)制提供了線索[18]。本研究表明，HLTF與Rad5催化差異巨大的PCNA的泛素化修飾及復(fù)制叉退行。因此，迫切需要對(duì)HLTF本身的結(jié)構(gòu)和功能研究以理解它在人體細(xì)胞的DNA復(fù)制壓力應(yīng)對(duì)中發(fā)揮作用的機(jī)制。制備大量、高純度且正確折疊的HLTF對(duì)該研究至關(guān)重要。雖然已有研究人員利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化HLTF[8]，但該表達(dá)系統(tǒng)操作較為繁瑣，蛋白產(chǎn)量也較為有限。與酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)通常耗時(shí)更短、蛋白產(chǎn)量更高。然而高等真核生物與細(xì)菌之間存在密碼子偏好性差異，可能會(huì)阻礙高等真核生物蛋白在細(xì)菌中的表達(dá)。這些物種細(xì)胞中蛋白折疊環(huán)境的差異，也可能導(dǎo)致在細(xì)菌中表達(dá)的高等真核生物蛋白不能正確折疊[19-21]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)優(yōu)化HLTF基因的密碼子偏好性能夠在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)HLTF[18]。本研究?jī)?yōu)化了HLTF的表達(dá)和純化方式，獲得了大量高純度的HLTF。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組HLTF具有完整的生化活性，提示它是正確折疊的。另外，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLTF在發(fā)揮泛素連接酶活性時(shí)對(duì)底物PCNA與泛素的連接方式不敏感。本研究提供了一種高效制備大量、高純度且折疊正確HLTF的方法，并為深入理解其泛素連接酶活性提供了線索，為HLTF的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蛋白表達(dá)和純化本研究對(duì)本課題組之前報(bào)道的HLTF的表達(dá)和純化方法進(jìn)行了優(yōu)化[18]。HLTF基因的密碼子偏好性優(yōu)化有利于其在大腸桿菌中表達(dá)，由化學(xué)方法合成（生工生物技術(shù)）。HLTF的氨基酸殘基46-1013對(duì)應(yīng)的基因片段插入pET28a載體（Novagen），構(gòu)建HLTF的表達(dá)質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在添加34 mg/L卡那霉素和25 mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用終濃度為0.25 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Bio Basic）在16℃誘導(dǎo)14 h。收集的細(xì)胞重懸在含有20 mmol/L Tris（pH 7.5）、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L苯甲基磺酰氟和2 mmol/Lβ-巰基乙醇的緩沖液中，每克細(xì)胞使用50 mL緩沖液重懸，冷卻到4℃，以50 mL/min的流速通過(guò)AH-2010高壓破碎儀（ATS Engineering），破碎壓力設(shè)為900磅每平方英尺。經(jīng)過(guò)3次破碎循環(huán)后，細(xì)胞裂解液經(jīng)過(guò)15 000×g離心50 min，上清部分經(jīng)過(guò)鎳-次氮基三乙酸純化瓊脂糖樹(shù)脂（nickel-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA，Smart-Lifesciences）、DEAE柱（Hitrap DEAE HP，GE Healthcare）、SP柱（Hitrap SP HP，GE Healthcare）和分子篩柱（Superose 6 10/300，GE Health care）依次純化，得到純度大于95%的HLTF蛋白。

從人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的cDNA文庫(kù)（天津醫(yī)科大學(xué)于林教授贈(zèng)送）中擴(kuò)增出泛素、PCNA的基因；從人乳腺癌T-47D細(xì)胞的cDNA文庫(kù)（天津醫(yī)科大學(xué)于林教授贈(zèng)送）中擴(kuò)增出Mms2基因。Ubc13基因密碼子優(yōu)化為利于在大腸桿菌中表達(dá)（生工生物技術(shù)）。將泛素基因插入pET28a載體；將Mms2基因插入pTYb2載體（New England Biolabs）；將Ubc13基因插入pTXb1載體（New England Biolabs），構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。將FLAG肽段寡核苷酸序列、泛素基因、連接肽段（VQIPGK）核苷酸序列和PCNA基因插入pET28a載體，構(gòu)建His-FLAG-泛素-PCNA融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。上述重組蛋白均在大腸桿菌BL21 Rosetta（DE3）細(xì)胞中表達(dá)。泛素和His-FLAG-泛素-PCNA融合蛋白均用Ni-NTA和分子篩柱純化（泛素蛋白用Superdex 75 Increase 10/300，His-FLAG-泛素-PCNA融合蛋白用Superdex 200 Increase 10/300，均來(lái)自GE Healthcare）。Mms2和Ubc13用幾丁質(zhì)樹(shù)脂（New England Biolabs）和分子篩柱（Superdex 75 Increase 10/300）進(jìn)行純化。

所有蛋白質(zhì)在含有20 mmol/L Tris（pH 7.5）、200 mmol/L NaCl和2 mmol/L二硫蘇糖醇的緩沖液中，用液氮速凍后保存在-80℃。

1.2 ATP酶活性實(shí)驗(yàn)ATP酶活性實(shí)驗(yàn)中使用的雙鏈DNA是通過(guò)將互補(bǔ)寡核苷酸（ACCAGTGCCAGTGAT和ATCACTGGCACTGGT，生工生物技術(shù)合成）加熱至95℃，隨后緩慢冷卻至4℃生成。實(shí)驗(yàn)采用丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶耦聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)監(jiān)測(cè)NADH減少來(lái)測(cè)定ATP酶活性[22]。利用ultraspec 2100 pro分光光度計(jì)（GE Healthcare）來(lái)監(jiān)測(cè)NADH在340 nm處吸收值的變化。反應(yīng)體系包括2.5μmol/L HLTF、40 mmol/L Tris（pH 7.5）、50 mmol/L NaCl、0.5 mmol/L ATP（Sigma）、1 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸（Sigma）、0.2 g/L NADH（Sigma）、80單位/mL丙酮酸激酶（源葉生物）、100單位/mL乳酸脫氫酶（源葉生物）、10 mmol/L MgCl2和不同濃度的雙鏈DNA。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用QTIPLOT分析（www.qtiplot.com）。

1.3 HLTF促進(jìn)自由泛素鏈的形成實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系包括20 mmol/L Tris（pH7.5）、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L ATP（Sigma）、0.02 mg/mL BSA、1 mmol/L DTT、33 nmol/L人源泛素激活酶（UBE1，R&D Systems）、667 nmol/L Ubc13、667 nmol/L Mms2、33μmol/L泛素和233 nmol/L HLTF。需要時(shí)，將單鏈DNA（序列為T(mén)TTTTTTCGTCTTCGGCAATTTTTTT，生工生物技術(shù)合成）或雙鏈DNA（與ATP酶活性實(shí)驗(yàn)相同）加入反應(yīng)體系中，終濃度為6.7μmol/L。

30℃孵育12 min后，加入SDS-PAGE上樣緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8），40 mmol/L DTT，0.8%SDS，0.02%溴酚藍(lán)，4%甘油]煮沸終止反應(yīng)。通過(guò)SDS-PAGE分析反應(yīng)結(jié)果。

1.4 HLTF催化PCNA的泛素鏈標(biāo)記實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系包括40 mmol/L Tris（pH7.5）、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L ATP（Sigma）、0.15μmol/L人源泛素激活酶（UBE1，R&D Systems）、2μmol/L Ubc13、2μmol/L Mms2、10μmol/L泛素、0.5μmol/L HLTF和0.05μmol/L His-FLAG-泛素-PCNA融合蛋白。30℃孵育30 min后，加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸終止反應(yīng)。用抗FLAG抗體（a8592，Sigma-Aldrich）進(jìn)行Western印跡分析反應(yīng)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組HLTF蛋白在細(xì)菌中的表達(dá)和純化DEAE柱可去除Ni-NTA純化HLTFec蛋白時(shí)殘留的大量雜蛋白和錯(cuò)誤折疊的蛋白。通過(guò)在純化流程的Ni-NTA柱步驟后添加DEAE柱步驟可以有效地提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和純化產(chǎn)物的純度。優(yōu)化的純化流程可從7 L的大腸桿菌培養(yǎng)液中制備6 mg純度大于95%的HLTFec蛋白（圖1A）。蛋白從Supersose 6 10/300分子篩柱的16 mL處洗脫出來(lái)（圖1B），與溶液中HLTF蛋白的單體形式一致（預(yù)期分子量為109 kD）。

圖1 HLTFec蛋白的純化Fig 1 Purification of HLTFec protein

2.2 重組HLTF的ATP水解酶活性在沒(méi)有雙鏈DNA時(shí)HLTFec只有非常小的ATP水解酶活性，而當(dāng)雙鏈DNA存在時(shí)該活性被強(qiáng)烈地促進(jìn)超過(guò)300倍（圖2）。數(shù)據(jù)分析顯示當(dāng)雙鏈DNA存在時(shí)，該活性的激活常數(shù)（Ka）為（81.4±14.1）nmol/L，該反應(yīng)的最大反應(yīng)比速率（定義為最大反應(yīng)速率除以HLTF的濃度，Vmax）為（4.3±0.2）/min。這些數(shù)據(jù)表明，HLTFec具有強(qiáng)大的受雙鏈DNA激活的ATP酶活性，與其催化復(fù)制叉退行的功能一致。

圖2 DNA激活的HLTFec的ATP酶活性Fig 2 DNA-stimulated ATPase activity of HLTFec

2.3 重組HLTF的泛素連接酶活性HLTFec可強(qiáng)烈地促進(jìn)泛素激活酶與Ubc13-Mms2復(fù)合物催化的自由泛素鏈的形成（圖3），說(shuō)明其具有很強(qiáng)的泛素連接酶活性。筆者發(fā)現(xiàn)加入雙鏈DNA或單鏈DNA會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)泛素鏈的形成。這些數(shù)據(jù)表明，HLTFec具有較強(qiáng)的泛素連接酶活性，且可被DNA激活。

圖3 HLTFec促進(jìn)Ubc13-Mms2復(fù)合物催化自由泛素鏈形成Fig3 Stimulation of free ubiquitin chain formation catalyzed by Ubc13-Mms2 complex through HLTFec

2.4 重組HLTF催化PCNA泛素鏈標(biāo)記的活性該反應(yīng)需要單泛素化的PCNA作為底物，在該底物中泛素以共價(jià)鍵連接在PCNA的164號(hào)位賴氨酸的側(cè)鏈上。本研究使用類似的泛素-PCNA融合蛋白作為底物檢測(cè)HLTFec是否能催化PCNA的泛素鏈標(biāo)記。結(jié)果表明，HLTFec可與Mms2、Ubc13、泛素激活酶等蛋白協(xié)作，在泛素-PCNA融合蛋白底物上催化PCNA的泛素鏈標(biāo)記（圖4）。這些數(shù)據(jù)表明，HLTFec可催化PCNA的泛素鏈標(biāo)記，且對(duì)底物中泛素與PCNA的連接方式不敏感。

圖4 HLTFec催化PCNA的泛素鏈標(biāo)記Fig 4 PCNA-anchored poly-ubiquitination by HLTFec

3 討論

在常用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)所需要的工作量和材料最少[23-24]。然而，由于真核生物和細(xì)菌在密碼子偏好性上存在差異，真核生物的蛋白一般無(wú)法很好地在細(xì)菌中表達(dá)[20-21]。此外，由于細(xì)菌與真核細(xì)胞中的蛋白折疊環(huán)境有很大的不同，一些真核生物的蛋白即使能在細(xì)菌中表達(dá)，也可能無(wú)法正確折疊從而缺乏生物活性[19]。在細(xì)菌中表達(dá)來(lái)自高等真核生物的大分子量多結(jié)構(gòu)域蛋白尤其困難。大分子量多結(jié)構(gòu)域的人源HLTF蛋白在細(xì)胞的DNA復(fù)制壓力應(yīng)對(duì)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)它的結(jié)構(gòu)和功能研究急需建立大規(guī)模制備高純度、折疊正確的HLTF的方法。本課題組前期的工作表明，通過(guò)優(yōu)化密碼子偏好性可以在大腸桿菌中表達(dá)HLTF。本研究?jī)?yōu)化了從大腸桿菌中制備HLTF的方案，建立了一個(gè)有效的制備大量、高純度的HLTF的方法。更為重要的是，體外實(shí)驗(yàn)表明制備的HLTF具有完整的生物活性，提示它是正確折疊的。已有報(bào)道表明HLTF可以使用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)[8]。該系統(tǒng)較為耗時(shí)，轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)蛋白表達(dá)需2周左右的時(shí)間。另外，研究人員僅利用該系統(tǒng)純化了少量的HLTF進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，能否將該系統(tǒng)用于制備結(jié)構(gòu)研究所需的大量、高純度、正確折疊的HLTF還不清楚。與該方法相比，本研究建立的方法耗時(shí)更短，細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)蛋白表達(dá)僅需2 d。而且，此方法可以方便的制備5～6 mg的高純度、正確折疊的HLTF。因此，本研究提供了一個(gè)有效的方案來(lái)制備正確折疊的HLTF蛋白，為該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

HLTF催化PCNA的泛素鏈標(biāo)記反應(yīng)以單泛素化的PCNA作為底物，其生成需要Rad18、Rad6、PCNA和復(fù)制因子C（replication factor C，RFC）將PCNA加載到雙鏈DNA上[8，25]。HLTF的酵母同源蛋白R(shí)ad5催化類似的反應(yīng)，也需要一組相似的蛋白因子[26]。然而，研究表明Rad5對(duì)泛素與PCNA之間的連接方式并不敏感，可以將泛素-PCNA融合蛋白作為底物來(lái)催化PCNA的泛素鏈標(biāo)記。本研究發(fā)現(xiàn)HLTF同樣對(duì)泛素與PCNA之間的連接方式不敏感，泛素-PCNA融合蛋白也可作為HLTF催化PCNA泛素鏈標(biāo)記反應(yīng)的底物。本課題組最近發(fā)現(xiàn)，Rad5和HLTF以截然不同的機(jī)制催化PCNA的泛素鏈標(biāo)記。Rad5通過(guò)其HIRAN結(jié)構(gòu)域招募PCNA并對(duì)其泛素化，而HLTF的HIRAN結(jié)構(gòu)域與PCNA沒(méi)有相互作用[18]。有意思的是，本研究表明，HLTF和Rad5催化的差異巨大的PCNA的泛素鏈標(biāo)記反應(yīng)對(duì)泛素-PCNA連接方式均不敏感。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解Rad5和HLTF催化的PCNA泛素鏈標(biāo)記反應(yīng)的機(jī)制提供線索，也提供一種操作簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)體系來(lái)研究HLTF催化的PCNA泛素鏈標(biāo)記反應(yīng)。