王雪梅

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型(>85%)，其病死率位居世界第二，近幾年肝細(xì)胞癌的新發(fā)病例數(shù)和死亡數(shù)逐年增長(zhǎng)，尤其在中國(guó)[1]。對(duì)于肝細(xì)胞癌早期的患者進(jìn)行肝臟切除、肝移植或局部消融有助于患者的預(yù)后，而晚期或肝硬化患者的預(yù)后很差[2]。微小RNA(miRNA)是一種短鏈非編碼的內(nèi)源保守的18～22個(gè)核苷酸之間的RNA片段，通過(guò)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯而抑制蛋白的表達(dá)，以此參與人類幾乎所有疾病的發(fā)展[3]。miR-452-5p為眾多新發(fā)現(xiàn)的miRNA之一[4]。m6A作為真核細(xì)胞mRNA上最常見的內(nèi)部修飾之一，對(duì)基因的表達(dá)十分重要[5]。YTH結(jié)構(gòu)域家族2(YTH domain family ,member 2，YTHDF2)是最有效的m6A結(jié)合蛋白，可通過(guò)結(jié)合含有m6A的結(jié)合位點(diǎn)的基因以削弱其穩(wěn)定性[6]。最新報(bào)道顯示，YTHDF2能夠降解腫瘤啟動(dòng)子并抑制癌基因的mRNA表達(dá)[7]。鐵死亡是近年提出的一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，主要依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵和脂質(zhì)活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累所引起的細(xì)胞死亡[8]。本研究旨在探索miR-452-5p、YTHDF2調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡、鐵死亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心；活性氧檢測(cè)試劑盒(DCFH-DA熒光探針法)購(gòu)自北京百奧萊博公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting Kit，CCK8)購(gòu)自日本同仁；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega；所有miR-con、miR-452-5p mimics、anti-miR-con、anti-miR-452-5p及引物的設(shè)計(jì)合成均委托上海吉瑪公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中含有5%CO2、95%O2的飽和濕度氣體環(huán)境中。每2 天更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組：將正常培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞設(shè)為L(zhǎng)02組、SMMC-7721組、HepG2組、Huh7組、Hep3B組。將不做任何處理的HepG2細(xì)胞設(shè)為NC組；使用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000將anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con)、anti-miR-452-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-452-5p)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-YTHDF2組(轉(zhuǎn)染pcDNA-YTHDF2)、anti-miR-452-5p+si-con組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-452-5p 和si-con)、anti-miR-452-5p+si-YTHDF2組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-452-5p 和si-YTHDF2)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞12 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，RT-qPCR或WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染是否成功。確認(rèn)成功后用于后續(xù)研究，否則繼續(xù)更換轉(zhuǎn)染條件至成功。

1.2.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)：收集需要檢測(cè)的細(xì)胞，Trizol液提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA，-20℃保存，作為模板備用。用RT-qPCR試劑盒檢測(cè)模板中miR-452-5p、YTHDF2的表達(dá)。以U6、GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-452-5p、YTHDF2的表達(dá)水平。擴(kuò)增程序設(shè)置為：94℃，2 min；94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，40 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，72℃，保存5 min。引物信息：miR-452-5p，上游引物5’-AAGAGGGCATGGAAACACTG-3’，下游引物5’-ACTCACCCCATTCTTCAAGG-3’；YTHDF2，上游引物 5’-GCTTGCCTGCTACATAGTGAGA-3’，下游引物5’-AACTGAACTGCTTAACCTTCTGG-3’。U6、GAPDH所用為通用引物。

1.2.4 ROS含量檢測(cè)：收集細(xì)胞，PBS充分洗滌。按照活性氧檢測(cè)試劑盒(DCFH-DA熒光探針法)的說(shuō)明書要求逐步操作，加入DCFH-DA，避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀在480 nm激發(fā)波長(zhǎng)/530 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)熒光強(qiáng)度，熒光顯微鏡下拍照細(xì)胞的熒光圖。

1.2.5 WB實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞中加入足夠量的RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白。然后對(duì)蛋白定量、變性，SDS-PAGE蛋白電泳。用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，再用含2.5%脫脂奶粉的封閉液對(duì)膜37℃封閉處理2 h。將膜浸泡再稀釋過(guò)的一抗稀釋液中，4℃孵育過(guò)夜，充分洗膜。再浸泡在稀釋的二抗溶液中37℃孵育2 h，充分洗膜。最后，用ECL發(fā)光液顯影曝光。

1.2.6 CCK8實(shí)驗(yàn)：收集待檢細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)至5×104個(gè)/ml，取200 μl置于96孔板，再加入10 μl的CCK8反應(yīng)液，避光孵育20 min。在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光度。細(xì)胞活性(%)=OD490實(shí)驗(yàn)組/OD490對(duì)照組×100。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：收集待檢測(cè)的細(xì)胞，充分洗滌5次，再用500 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞。依次加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI避光反應(yīng)10 min，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡。總凋亡率(%)= 早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：生物信息學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站Starbase(https://starbase.sysu)預(yù)測(cè)miR-452-5p的靶位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)YTHDF2的3’UTR與miR-452-5p存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。化學(xué)合成YTHDF2-WT(含YTHDF2 3’UTR)和YTHDF2-MUT(不含YTHDF2 3’UTR)，并將其插入熒光載體，構(gòu)建熒光報(bào)告基因載體。YTHDF2-WT和YTHDF2-MUT報(bào)告載體分別與miR-con、miR-452-5p、anti-miR-con、anti-miR-452-5p共轉(zhuǎn)染基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌細(xì)胞中miR-452-5p和YTHDF2的表達(dá) 與L02組比較，SMMC-7721、HepG2、Huh7、Hep3B組miR-452-5p表達(dá)升高(P<0.05)，YTHDF2 mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 YTHDF2蛋白電泳圖

表1 miR-452-5p和YTHDF2在L02、SMMC-7721、HepG2、Huh7和Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 抑制miR-452-5p調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞增殖 與anti-miR-con組比較，anti-miR-452-5p組HepG2細(xì)胞miR-452-5p表達(dá)和細(xì)胞活性均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 抑制miR-452-5p的HepG2細(xì)胞增殖

2.3 抑制miR-452-5p對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡、鐵死亡的調(diào)控 與anti-miR-con組比較，anti-miR-452-5p組HepG2細(xì)胞凋亡率、ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 抑制miR-452-5p的HepG2細(xì)胞的凋亡、鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；A HepG2細(xì)胞ROS含量；B HepG2細(xì)胞凋亡圖；C HepG2細(xì)胞SLC7A11、GPX4和FTH1蛋白表達(dá)

表3 抑制miR-452-5p誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡

2.4 miR-452-5p靶向調(diào)控YTHDF2的表達(dá) miR-452-5p組YTHDF2-WT細(xì)胞的熒光活性顯著低于miR-con組；與miR-con組相比，miR-452-5p組YTHDF2蛋白表達(dá)顯著降低，與anti-miR-con組相比，anti-miR-452-5p組YTHDF2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖3,表4。

圖3 miR-452-5p靶向調(diào)控YTHDF2;A miR-452-5p與YTHDF2的靶向序列；B HepG2細(xì)胞中YTHDF2蛋白表達(dá)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果及miR-452-5p調(diào)控YTHDF2的表達(dá)

2.5 過(guò)表達(dá)YTHDF2調(diào)控HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡 與pcDNA組比較，pcDNA-YTHDF2組HepG2細(xì)胞中YTHDF2蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 過(guò)表達(dá)YTHDF2對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡的影響；A HepG2細(xì)胞ROS的含量；B HepG2細(xì)胞的凋亡圖；C HepG2細(xì)胞中YTHDF2、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達(dá)

表5 過(guò)表達(dá)YTHDF2抑制HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡

2.6 敲減YTHDF2部分逆轉(zhuǎn)anti-miR-452-5p對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡的作用 與anti-miR-452-5p+si-con組比較，anti-miR-452-5p+si-YTHDF2組HepG2細(xì)胞YTHDF2蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率降低，ROS含量、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見表6，圖5。

表6 敲減YTHDF2的anti-miR-452-5p處理HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡情況

圖5 敲減YTHDF2對(duì)anti-miR-452-5p調(diào)控HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡的影響;A ROS含量的熒光圖；B HepG2細(xì)胞凋亡圖；C HepG2細(xì)胞YTHDF2、SLC7A11、GPX4和FTH1的蛋白表達(dá)

3 討論

miR-452-3p/5p參與人類多種癌癥的進(jìn)展，如胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等[9,10]。雖有大量證據(jù)顯示miRNA參與癌癥的惡化進(jìn)程的調(diào)控，但是其調(diào)控的機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍在探索之中。Tang等[4]報(bào)道，miR-452-3p在肝癌樣本中的表達(dá)異常升高，并且過(guò)度表達(dá)miR-452-3p促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移，抑制凋亡，這與miR-452-3p直接靶向抑制CPEB3/EGFR信號(hào)通路的活性存在聯(lián)系。Yang等[11]在肝癌的研究中報(bào)道，circ-ABCB10在體內(nèi)和體外均抑制肝癌的惡性進(jìn)展，其機(jī)制與抑制miR-340-5p/miR-452-5p-NRP1/ABL2信號(hào)通路的活性相關(guān)，為肝癌的靶向治療提供新靶點(diǎn)。Zheng等[12]最新研究報(bào)道，miR-452-5p在肝癌中的表達(dá)顯著升高，并作為癌基因參與肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制為靶向COLEC10。這些研究說(shuō)明miR-452-5p參與肝癌的惡化過(guò)程且作用機(jī)制多種多樣，但是其是否與肝癌細(xì)胞的鐵死亡存在聯(lián)系尚未可知。本研究檢測(cè)了正常肝細(xì)胞和肝細(xì)胞癌細(xì)胞中miR-452-5p的表達(dá)，結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致，即miR-452-5p在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中高表達(dá)。抑制miR-452-5p抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡和鐵死亡以及鐵死亡相關(guān)基因ROS、SLC7A11、GPX4和FTH1的表達(dá)，這與前人關(guān)于miR-452-5p的研究結(jié)果[11,12]相吻合。進(jìn)一步研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-452-5p靶向YTHDF2，也許YTHDF2可能與miR-452-5p調(diào)控肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡和鐵死亡存在聯(lián)系。

m6A作為真核生物中最普遍的mRNA修飾之一，其在許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用，如mRNA穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)翻譯、病毒感染和胚胎發(fā)育[13,14]。YTHDF2(YTH結(jié)構(gòu)域家族成員2)是功能性m6A結(jié)合蛋白的明星基因，其主要調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。YTDF2通過(guò)其C-末端YTH(YT521 B同源)結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合mRNA 3’UTR位點(diǎn)，加速靶基因的降解[15]。據(jù)報(bào)道，YTHDF2在胰腺癌細(xì)胞中具有促進(jìn)增殖和抑制遷移和侵入的雙重作用[16]。Hou等[17]發(fā)現(xiàn)，YTHDF2在肝癌組織中的表達(dá)顯著降低，這是由缺氧誘導(dǎo)因子-2α(HIF-2α)介導(dǎo)的，HIF-2α抑制劑或過(guò)表達(dá)YTHDF2可恢復(fù)YTHDF2的表達(dá)并抑制肝癌細(xì)胞的增殖和裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制與YTHDF2直接結(jié)合EGFR的 3’-UTR有關(guān)。但Shao等[18]報(bào)道，YTHDF2在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，與患者的不良預(yù)后、癌細(xì)胞浸潤(rùn)緊密相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，與Hou等[17]的研究結(jié)果相一致，與Shao等[18]的研究結(jié)果相悖。過(guò)表達(dá)YTHDF2明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡，并且敲減YTHDF2還可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-452-5p對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡、鐵死亡的促進(jìn)作用。

綜上所述，抑制miR-452-5p促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡、鐵死亡，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與直接靶向YTHDF2有關(guān)，為肝細(xì)胞癌的精準(zhǔn)治療提供新靶點(diǎn)。