尹 皚

(眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院 ， 四川 眉山 620000)

加味烏梅散水提物是由2015版獸藥典中烏梅散加減而來(lái)，主要由烏梅、黃連、姜黃、訶子、黨參、白術(shù)和茯苓組成，并通過(guò)煎煮后噴霧干燥而成。加味烏梅散方中烏梅具有斂肺、澀腸、生津、安蛔之功效，黃連清熱燥濕、瀉火解毒，共為君藥，具有解熱、抗炎、抗菌等藥理作用；以苦寒之姜黃、訶子為臣，破血行氣，通經(jīng)止痛，澀腸止瀉；黨參、白術(shù)、茯苓健脾益氣、利水滲濕為佐[1]。全方配伍，共奏清熱解毒、澀腸止瀉、健脾益氣之功。為了探討加味烏梅散更多的藥理作用，本試驗(yàn)通過(guò)傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法研究烏梅散水提物的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用，以期為加味烏梅散的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠150只，體重(20±2)g，雌雄各半；SD大鼠60只，體重(160±10) g，雌雄各半，均購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào):SCXK(川) 2014—028。專人飼養(yǎng)管理，自由飲食。常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，根據(jù)需要選擇健康小鼠、大鼠開(kāi)展試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)藥物 加味烏梅散水提物，由實(shí)驗(yàn)室自制：將中藥烏梅150 g、黨參150 g、黃連100 g、姜黃100 g、訶子120 g、白術(shù)80 g、茯苓80 g粉碎后過(guò)10目篩，提取3 次，第1 次加20 倍量水浸泡1 h 后煎煮2 h，第2 次加15倍量水煎煮1.5 h，第3次加10倍量水煎煮1 h，紗布、藥棉過(guò)濾后合并濾液，在80 ℃下真空減壓濃縮至相對(duì)密度為1.2 g/mL，得到提取濃縮液。濃縮液4 000 g離心30 min，過(guò)濾，濾液噴霧干燥即得(每1 g相當(dāng)于原生藥材10 g)；拜阿司匹靈腸溶片，購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司(規(guī)格:100 mg/片)。

1.3 主要儀器與試劑 電子天平(型號(hào)為JA1003N)，購(gòu)自上海菁華儀器有限公司；數(shù)字溫度計(jì)(型號(hào)為MC-6830L)，購(gòu)自日本歐姆龍公司；智能熱板儀(型號(hào)為ZH-YLS-6BS)，購(gòu)自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)為Multiskan FC)，購(gòu)自賽默飛世爾儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào)為JIDI-4D-WS)，購(gòu)自廣州吉迪儀器有限公司。二甲苯、醋酸、伊文思藍(lán)等生化試劑，均購(gòu)自成都科飛試劑公司；安琪高活性干酵母，購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 加味烏梅散水提物對(duì)干酵母致大鼠發(fā)熱影響試驗(yàn) 選擇健康SD 大鼠(雌雄各半)60 只，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組10 只。分別為對(duì)照組、模型組、阿司匹林組及加味烏梅散水提物低、中、高劑量組，同時(shí)記錄基礎(chǔ)溫度。對(duì)照組與模型組分別按照純化水1 mL/(100 g·bw)灌胃，阿司匹林組按照100 mg/(kg·bw)灌胃，加味烏梅散水提物低、中、高劑量組按照20、40 mg/(kg·bw)和80 mg/(kg·bw)的劑量灌胃，各組灌胃總?cè)萘慷及凑? mL/(100 g·bw)進(jìn)行，1 次/d，連續(xù)給藥7 d。第7天灌胃結(jié)束后，禁食12 h，每只SD大鼠背部按7 mL/(kg·bw)皮下注射20% 酵母混懸液，并測(cè)定其注射后1、2、3 h和4 h的肛溫，記錄體溫變化。

1.4.2 加味烏梅散水提物對(duì)熱板致小鼠疼痛試驗(yàn) 將健康雌性小鼠放入溫度設(shè)置為(55.0±0.5)℃的智能熱板儀內(nèi)，觀察小鼠出現(xiàn)舔后肢或扭頭為痛作為指標(biāo)，記錄痛閾值，間隔10 min再測(cè)定1次，在5～30 s 出現(xiàn)疼痛反應(yīng)的小鼠為疼痛試驗(yàn)合格小鼠。選取合格小鼠50只，隨機(jī)分成對(duì)照組、阿司匹林組、加味烏梅散水提物低、中、高劑量組。其中，對(duì)照組按0.1 mL/(10 g·bw)灌純化水；阿司匹林組按100 mg/(kg·bw)灌胃給藥阿司匹林，加味烏梅散水提物低、中、高劑量組以大鼠與小鼠等量換算后按照30、 60 mg/(kg·bw)和120 mg/(kg·bw)的劑量灌胃，各組灌胃容量都按照0.1 mL/(10 g·bw)進(jìn)行，1 次/d，連續(xù)給藥7 d。測(cè)定末次給藥后60 min 時(shí)的痛閾值(以60 s進(jìn)行計(jì)算)。按照公式(1)計(jì)算痛閾提高百分率。

痛閾提高百分率/%=(用藥后平均痛閾值-用藥前平均痛閾值)/用藥前平均痛閾值×100%

(1)

1.4.3 加味烏梅散水提物對(duì)醋酸致小鼠扭體影響試驗(yàn) 試驗(yàn)取健康雄性KM小鼠50只，隨機(jī)分為5個(gè)組:對(duì)照組、阿司匹林組、加味烏梅散水提物低、中、高劑量組，并按1.4.2方法給藥。末次給藥30 min 后，各組小鼠均按0.1 mL/(10 g·bw) 腹腔注射新配制的0.6%醋酸溶液。觀察醋酸溶液注射后20 min 內(nèi)的扭體反應(yīng)次數(shù)。比較各組的扭體次數(shù)，按照公式(2)計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率。

鎮(zhèn)痛百分率/%=(對(duì)照組平均扭體次數(shù)-試驗(yàn)組平均扭體次數(shù))/對(duì)照組平均扭體次數(shù)×100%

(2)

1.4.4 加味烏梅散水提物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹影響試驗(yàn) 取健康KM小鼠50 只，雌雄各半，分組及給藥同1.4.2。于末次給藥30 min 后，用二甲苯以0.03 mL/只劑量均勻涂抹小鼠右耳兩面致炎。30 min 后處死小鼠，并用打孔器(直徑8 mm)對(duì)左右耳取樣，電子天平稱重，按照公式(3)以兩耳的重量差表示腫脹度，并按照公式(4)計(jì)算腫脹抑制率。

腫脹度=右耳耳片質(zhì)量-左耳耳片質(zhì)量

(3)

腫脹抑制率/%=[(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度]×100%

(4)

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行顯著檢驗(yàn)，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行組間顯著性比較，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05 為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 加味烏梅散水提物對(duì)干酵母致大鼠發(fā)熱的影響 由表1可知，大鼠皮下注射酵母后，除對(duì)照組外，各組平均體溫至少升高1 ℃，符合試驗(yàn)要求。各組基礎(chǔ)體溫和給藥前的體溫?zé)o顯著差異(P>0.05)。給藥1 h后，模型組的體溫比對(duì)照組顯著提高6.78%(P<0.05)；阿司匹林組的體溫比模型組顯著降低3.34%(P<0.05)。加味烏梅散水提物低、中、高劑量各組的體溫比對(duì)照組分別顯著提高7.02%、6.45%、6.50%(P<0.05)；與阿司匹林組比較顯著提高4.02%、3.46%、3.52%(P<0.05)。給藥2 h時(shí)，模型組與對(duì)照組比較，大鼠體溫顯著提高5.59%(P<0.05)；阿司匹林組與模型組比較顯著降低3.35%(P<0.05)；加味烏梅散水提物低、中、高劑量各組與對(duì)照組比較，大鼠體溫顯著提高5.67%、4.91%、3.32%(P<0.05)；低、中劑量組與阿司匹林組比較顯著提高3.54%、2.80%(P<0.05)。給藥3 h后，模型組與對(duì)照組比較，大鼠體溫顯著提高5.68%(P<0.05)；阿司匹林組與模型組比較顯著降低3.60%(P<0.05)。加味烏梅散水提物僅低劑量組比對(duì)照組、阿司匹林組顯著提高5.60%、3.66%(P<0.05)；高劑量組比模型組顯著降低2.70%(P<0.05)。給藥4 h后，模型組仍然顯著高于對(duì)照組3.80%(P<0.05)；阿司匹林組、加味烏梅散水提物中、高劑量組分別與模型組比較顯著降低3.43%、1.74%、2.18%(P<0.05)。

表1 加味烏梅散水提物對(duì)干酵母致大鼠發(fā)熱的影響Table 1 Effect of modified plum powder of water extracts on fever in rats (℃)

2.2 加味烏梅散水提物對(duì)熱板致小鼠疼痛的影響 由表2可知，各組基礎(chǔ)痛閾值差異不顯著(P>0.05)。阿司匹林組、加味烏梅散水提物中、高劑量組給藥后痛閾值分別比對(duì)照組顯著提高39.02%、23.41%、24.39%(P<0.05)。各組痛閾提高百分率比較，阿司匹林組顯著高于對(duì)照組407.77%(P<0.05)、低劑量組263.51%(P<0.05)、中劑量組55.54%(P<0.05)、高劑量組26.88%(P<0.05)；高劑量組顯著高于對(duì)照組300.19%(P<0.05)、低劑量組186.49%(P<0.05)；中劑量組顯著高于對(duì)照組226.45%(P<0.05)、低劑量組133.71%(P<0.05)。

表2 加味烏梅散水提物對(duì)熱板致小鼠疼痛的影響Table 2 Effect of modified plum powder of water extracts on pain induced by heat stimulation in mice

2.3 加味烏梅散水提物對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響 由表3可知，阿司匹林組、加味烏梅散水提物低、中、高劑量組扭體次數(shù)分別顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。阿司匹林組扭體次數(shù)顯著低于加味烏梅散水提物不同劑量組(P<0.05)。加味烏梅散水提物中、高劑量組分別顯著低于低劑量組(P<0.05)。同時(shí)，阿司匹林的抑制率最高達(dá)到71.26%；加味烏梅散水提物中、高劑量組抑制率比較接近，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低劑量組。

表3 加味烏梅散水提物對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響Table 3 Effect of modified plum powder of water extracts on acetic acid-induced writhing in mice

2.4 加味烏梅散水提物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 由表4可知，各組腫脹度比較，阿司匹林組、加味烏梅散水提物低、中、高劑量組分別顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。阿司匹林組顯著低于加味烏梅散水提物各劑量組(P<0.05)。加味烏梅散水提物中、高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.05)。阿司匹林組腫脹抑制率最高達(dá)63.58%；加味烏梅散水提物中、高劑量組腫脹抑制率接近，都比低劑量組高，呈現(xiàn)劑量依賴性。

表4 加味烏梅散水提物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響Table 4 Effect of flavoured black plum extract on xylene induced ear swelling in mice

3 討論

3.1 加味烏梅散水提物解熱作用 發(fā)熱在獸醫(yī)臨床上是最常見(jiàn)的一種癥狀，引起的原因復(fù)雜，主要有環(huán)境變化、病毒、細(xì)菌、毒素侵害等，會(huì)導(dǎo)致畜禽生理機(jī)能紊亂甚至造成動(dòng)物死亡。干酵母致大鼠發(fā)熱模型是一個(gè)經(jīng)典的發(fā)熱模型，應(yīng)用非常廣泛，是干酵母所含的莢膜多糖和蛋白質(zhì)引發(fā)的劇烈炎癥反應(yīng)導(dǎo)致。加味烏梅散水提物中烏梅及其制劑對(duì)多種細(xì)菌有體外抑制作用[2]。王燕枝等[3]已經(jīng)證實(shí)，黃連葉、須、根的浸膏、原粉對(duì)酵母致大鼠發(fā)熱模型有較好的解熱作用。訶子、姜黃具有抗菌抗炎作用，這可能是加味烏梅散發(fā)揮解熱作用的重要原因之一[4-5]。陸俊林[6]采用烏梅散加減方治療豬傳染性胃腸炎，發(fā)揮其解熱作用。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了加味烏梅散水提物高劑量組在給藥2 h發(fā)揮解熱作用，大鼠體溫開(kāi)始呈降低趨勢(shì)，3 h后恢復(fù)到正常水平。加味烏梅散水提物對(duì)酵母引起的機(jī)體發(fā)熱具有一定的解熱作用，與其中的組成成分發(fā)揮抗菌和抗炎作用有一定關(guān)系。

3.2 加味烏梅散水提物鎮(zhèn)痛作用 疼痛是組織損傷以后引起的傷害性感覺(jué)，也是一種預(yù)警機(jī)制，防止機(jī)體遭受壓迫或進(jìn)一步損傷。熱板法、扭體法是經(jīng)典發(fā)快痛試驗(yàn)?zāi)Ｐ停Ｓ糜诤Y選中樞鎮(zhèn)痛藥[7]。加味烏梅散水提物中烏梅組方能有效延長(zhǎng)痛閾值[8]；黃連及其成分也能發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[9]；姜黃的成分姜黃素也有較好的鎮(zhèn)痛作用[10]；訶子水提物能延長(zhǎng)小鼠痛閾值[11]；白術(shù)對(duì)熱板刺激致痛有較明顯的抑制作用[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，加味烏梅散水提物中、高劑量組能顯著增加痛閾值，還能抑制醋酸引起的疼痛反應(yīng)，減少小鼠的扭體次數(shù)，說(shuō)明該水提物對(duì)物理、化學(xué)刺激疼痛有良好的鎮(zhèn)痛作用，主要與組方中烏梅、黃連、姜黃等成分有關(guān)。

3.3 加味烏梅散水提物抗炎作用 炎癥是具有血管系統(tǒng)的生物機(jī)體對(duì)損傷因子所發(fā)生的復(fù)雜的防御機(jī)制。加味烏梅散中烏梅能抑制二甲苯所致的耳腫脹[13]；川黃連對(duì)化學(xué)刺激性潰瘍有抗炎作用[14]；姜黃、訶子、白術(shù)也能抗急性炎癥[11，15-16]。本試驗(yàn)觀察加味烏梅散水提物對(duì)二甲苯導(dǎo)致滲出、腫脹的影響，結(jié)果證實(shí)，加味烏梅散水提物低、中、高劑量組均對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有顯著抑制作用，對(duì)急性炎癥有效。

綜上所述，加味烏梅散水提物具有一定的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎作用，且呈劑量依賴性。本試驗(yàn)結(jié)果將為加味烏梅散水提物的臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。