熊昊杰 申晨晨 馬 艷

砷是廣泛分布于自然界的類金屬元素，多數流行病學研究、體內及體外細胞實驗表明，砷暴露具有神經毒性。大腦作為砷中毒的靶器官之一，砷可以透過血-腦脊液屏障或胎盤屏障在腦組織中蓄積，長期接觸會導致慢性砷中毒進而增加神經系統(tǒng)紊亂的風險[1～4]。由于神經細胞對有毒物質較為敏感且不容易再生，使得砷對神經系統(tǒng)的毒性研究顯得尤為重要。目前砷致神經發(fā)育毒性的具體機制尚不明確，其多集中在凋亡、氧化應激、信號通路改變等方面，而信號通路的交叉融合對砷誘導的細胞凋亡及其之間的相互關系受到廣泛關注[5～8]。有研究表明，核因子-類胡蘿卜素2相關因子(nf-e2-related factor 2，Nrf2)、河馬(Hippo)信號通路的激活和調控是影響細胞凋亡的關鍵因素之一[9, 10]。而關于砷致神經干細胞凋亡的機制研究相對較少，因此，本研究主要研究亞砷酸鈉對小鼠神經干細胞(NE-4C細胞)增殖、Nrf2及Hippo信號通路相關分子表達水平的影響，從分子水平上探究砷致神經干細胞損傷的可能機制。

材料與方法

1.細胞株：小鼠神經干細胞(NE-4C細胞)，購自廣州吉妮歐公司。

2.試劑與儀器：亞砷酸鈉(NaAsO2，分析純)購自北京化學試劑三廠；胎牛血清購自美國Sigma公司；MEM低糖培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；0.25%胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、谷氨酰胺、PBS緩沖液購自美國HyClone公司；RIPA裂解液、細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶公司；兔抗小鼠Nrf2單克隆抗體購自中國萬類生物公司、兔抗小鼠HO-1單克隆抗體購自英國Abcam公司、兔抗小鼠Keap1單克隆抗體購自中國萬類生物公司； Anti-rabbit IgG-HRP購自美國CST公司Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、QuantiNova SYBR Green PCR Kit購自日本TaKaRa公司；高速離心機購自美國Sigma公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；化學發(fā)光凝膠成像儀購自美國Protein Simple公司；三色預染Marker、PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

3.細胞培養(yǎng)及分組：NE-4C細胞用含10%胎牛血清的MEM(含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%谷氨酰胺)于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，用0.5%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對數生長期細胞開展后續(xù)實驗。藥物干預時間按照參考文獻及預實驗結果確定干預時長為48h。實驗分組按照亞砷酸鈉干預細胞48h的IC50=1.608μmol/L分為0(對照組)、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L組。

4.CCK-8檢測亞砷酸鈉對NE-4C細胞活力的影響：從培養(yǎng)箱中取出處于對數生長期的細胞(NE-4C細胞密度達到80%～90%)，胰酶消化、離心、吸棄上清后，加1ml完全培養(yǎng)基，吹打混勻制備成細胞懸液，根據細胞計數結果，吸取一定量的細胞懸液進行稀釋并將懸液吸取100μl接種至96孔板中，每孔個數為3×103，每組設置3個復孔，放入37℃培養(yǎng)箱過夜，第2天早上吸棄上清，加入不同濃度的亞砷酸鈉溶液，連續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl的CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2h后，酶標儀測定450nm吸光度值。

5.Western blot法檢測Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達：染毒結束后，收集細胞于冰上裂解30min。4℃、12000r/min離心10min，取上清進行BCA 蛋白定量。蛋白變性后取20～30μg進行上樣，電泳、轉膜，5%的脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次10min，二抗室溫孵育1h，洗膜3次后進行顯影，采用Image J進行灰度值分析。

6.qRT-PCR檢測Hippo信號通路相關分子mRNA表達：染毒結束后，利用Trizol法提取細胞總RNA，并測定樣品的濃度和純度。根據反轉錄試劑盒說明書以總RNA為模板反轉錄合成cDNA，利用Primer-Blast軟件設計針對 MST1、SAV1、MOB1、LATS1、YAP的熒光定量PCR引物并合成(生工生物工程股份有限公司)，引物序列詳見表1。根據熒光定量試劑盒說明書建立熒光定量PCR反應體系，采用2-ΔΔCt值表示mRNA的相對表達量。

表1 實驗中所使用mRNA引物序列

結 果

1.亞砷酸鈉對NE-4C細胞凋亡的影響：不同濃度亞砷酸鈉干預NE-4C細胞48h后，CCK-8結果顯示，與對照組比較，0.2和0.4μmol/L組細胞活力高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義；0.6～1.0μmol/L亞砷酸鈉染毒的細胞活力呈逐漸下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；1.5～4.0μmol/L亞砷酸鈉染毒的細胞活力明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2，圖1)。

表2 亞砷酸鈉對NE-4C細胞活力的影響

圖1 亞砷酸鈉對NE-4C細胞活力的影響A.細胞活力柱狀圖；B.細胞活力曲線圖。與0μmol/L比較，*P<0.05

2.亞砷酸鈉對NE-4C細胞Nrf2、Keap1、HO-1蛋白表達的影響：不同濃度亞砷酸鈉干預NE-4C細胞48h后，Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，0.8、1.6、2.4、3.2μmol/L組HO-1蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，2.4、3.2μmol/L組Nrf2蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，1.6、2.4、3.2μmol/L組Keap1蛋白表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果詳見表3和圖2。

表3 亞砷酸鈉對NE-4C細胞氧化應激相關蛋白表達的影響

圖2 亞砷酸鈉對NE-4C細胞氧化應激相關蛋白表達的影響A.免疫蛋白印跡法結果；B.蛋白表達水平柱狀圖。與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3.亞砷酸鈉對NE-4C細胞Hippo信號通路核心分子mRNA表達的影響：不同濃度亞砷酸鈉干預NE-4C細胞48h后，RT-PCR結果顯示，與對照組比較，2.4、3.2μmol/L組MST1mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，1.6、2.4、3.2μmol/L組MOB1mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，1.6、2.4、3.2μmol/L組SAV1mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，2.4、3.2μmol/L組LATS1mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，1.6、2.4、3.2μmol/L組YAPmRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表4，圖3)。

表4 亞砷酸鈉對NE-4C細胞Hippo信號通路核心分子mRNA表達的影響

圖3 亞砷酸鈉對NE-4C細胞Hippo信號通路核心分子mRNA表達的影響與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

討 論

砷及其化合物具有明顯的神經發(fā)育毒性，研究證明砷通過誘導凋亡、自噬、壞死等引發(fā)神經細胞死亡。有研究認為，極低劑量砷對人體有益，如刺激造血、促進細胞增殖等。本研究結果顯示，極低劑量(0.2μmol/L)砷可促進細胞的增殖，而隨著亞砷酸鈉濃度的增加活力降低，抑制了細胞增殖。長期接觸砷對機體中樞及外周神經系統(tǒng)造成不同程度的損害，進而影響機體某些神經行為功能、子代的神經發(fā)育和調節(jié)系統(tǒng)等[4]。目前，氧化應激被認為是砷致神經細胞毒性損傷的重要機制之一，其受控于諸多因素調節(jié)，如信號通路、酶活性等，但具體機制尚不明確。正常情況下，機體處于氧化-抗氧化的動態(tài)平衡狀態(tài)，當遭受某種有害刺激時，細胞及機體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)產生過多，氧化程度超出機體的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡被打破，從而導致細胞損傷[11]。

本研究結果顯示，亞砷酸鈉干預染毒可以誘導NE-4C細胞內ROS產生，提示亞砷酸鈉可引起細胞產生氧化應激，而氧化應激可激活細胞內抗氧化系統(tǒng)。抗氧化反應多表現為清除ROS和修復受損細胞的生物分子。Nrf2作為細胞抗氧化系統(tǒng)中的核轉錄因子，被Kelch樣ECH聯合蛋白1(recombinant Kelch like ECH associated protein 1，Keap1)錨定在細胞質而被蛋白酶體降解，Keap1作為Nrf2活性的抑制劑，在Nrf2活性的調控中起著關鍵作用[12,13]。此外，Keap1也是氧化應激的“傳感器”。在發(fā)生氧化應激后，Nrf2與Keap1分離后進入細胞核，激活下游相關靶基因，如血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)，同時與小Maf(small Maf proteins，sMafs)蛋白結合成異二聚體，然后結合抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)，以此來激活下游相關分子的基因轉錄，增強細胞的解毒及抗氧化能力，維持細胞氧化還原狀態(tài)的動態(tài)平衡[13]。

HO-1蛋白作為熱休克蛋白中的一種，在正常組織中幾乎不表達，當細胞受到氧化應激時，HO-1大量產生以提高機體的抗氧化水平，減少機體對氧化應激的敏感度，維持機體正常生存并減少細胞凋亡的發(fā)生[14]。Abiko等[15]將肝癌細胞暴露于砷中，結果顯示，HO-1可被持續(xù)激活并伴隨Nrf2激活時間延長，而HO-1基因敲除可降低Nrf2激活時間。同時使用HO-1抑制劑預處理可增強砷暴露誘導的細胞毒性作用，表明HO-1可能是Nrf2激活的正反饋調節(jié)因子。Reichard等[16]研究認為，砷不僅會引起Nrf2的激活而且也會引起HO-1轉錄抑制因子Bach1的失活，因此當細胞暴露于砷環(huán)境時，會出現HO-1的持續(xù)激活。本研究結果顯示，不同濃度亞砷酸鈉作用于NE-4C細胞后，Nrf2、HO-1蛋白表達隨亞砷酸鈉濃度的增加而升高，Keap1蛋白的表達隨亞砷酸鈉濃度的增加而降低，提示亞砷酸鈉激活了NE-4C細胞抗氧化系統(tǒng)中Nrf2通路以抵抗氧化應激損傷。

細胞的增殖、凋亡并不是受單一信號通路調控。Hippo 通路中的相關分子或激酶也通過促進或抑制細胞內很多其他信號通路來發(fā)揮其相應的作用，共同調節(jié)著機體正常的生命活動。哺乳動物Hippo信號通路的核心是一個激酶級聯，其高度保守且通過調控細胞增殖或凋亡來決定器官大小，在生長發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮關鍵作用[17]。在此通路中，上游信號活化哺乳動物 STE20 激酶(mammalian STE20-like protein kinase 1/2，MST1/2)后，與Salvador同系物1(Salvador homolog 1，SAV1)蛋白結合成復合物，繼而磷酸化下游激酶腫瘤抑制基因1/2(large tumour suppressor 1/2，LATS1/2)，活化的LAST1/2與Mps結合激酶激活物1(Mps once binder kinase activator-like 1，MOB1)相結合磷酸化下游核心效應分子Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)及其旁系同源分子，YAP無法與DNA直接結合，必須與TEA結構域家族轉錄因子(transcriptional enhancer associate domain family members，TEAD)等轉錄因子相互作用才能介導下游靶基因的表達調控。阻斷Hippo信號通路或該通路核心成員缺失將導致YAP入核增加，與轉錄因子TEAD等結合并誘導與細胞增殖、存活和遷移有關的一系列基因的表達[18,19]。

本研究結果顯示，與對照組比較，不同濃度亞砷酸鈉干預NE-4C細胞48h后，Hippo信號通路關鍵分子MST1、MOB1、SAV1、YAP mRNA表達水平隨亞砷酸鈉濃度的增加而升高。LATS mRNA表達水平隨亞砷酸鈉濃度的升高呈現先降低后升高的趨勢。表明亞砷酸鈉可激活Hippo信號通路。而經典的Hippo信號通路激活之后，YAP入核減少從而降低其表達，與本研究結果顯示YAP mRNA表達增加不一致。以上情況可能跟NE-4C細胞缺少p53基因有關。有研究發(fā)現，在p53缺失的小鼠自發(fā)性淋巴瘤中通常表現出YAP的上調，而YAP的變化與MST1的活性無關。這似乎證明p53的缺失和YAP的聯合上調是通過一種未知的機制獲得了一種選擇性優(yōu)勢[20]。Li等[21]研究發(fā)現，砷可誘導染砷小鼠皮膚Hippo信號通路核心分子蛋白表達增加，且砷可獨立于Hippo信號通路來激活YAP。這與本研究結果相一致，因此本研究認為，亞砷酸鈉可以激活Hippo信號通路，同時也獨立于Hippo信號通路激活YAP，其具體激活機制還有待于深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現亞砷酸鈉可抑制NE-4C細胞增殖，誘導細胞抗氧化分子Nrf2通路激活以抵抗氧化應激；同時亞砷酸鈉可誘導Hippo信號通路激活，且可獨立于Hippo信號通路激活YAP，但其具體激活機制尚需開展進一步研究予以證實。