賀 乙，范麗娜，武亦閣，周 光

(新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011)

濕疹是由多種內(nèi)、外因素引起的一種炎癥性、變態(tài)反應(yīng)性皮膚病，皮疹好發(fā)于手足、小腿、肘窩、肛門等處，多對(duì)稱發(fā)病。慢性濕疹常由急性濕疹及亞急性濕疹遷延而來，臨床表現(xiàn)為丘疹、鱗屑、苔蘚樣變伴陣發(fā)性的劇烈瘙癢等，呈反復(fù)發(fā)作，影響患者的生活質(zhì)量。目前研究認(rèn)為濕疹發(fā)病與表皮通透屏障功能障礙有關(guān)[1]，表皮通透屏障功能破壞，皮膚“磚墻結(jié)構(gòu)”不穩(wěn)定,經(jīng)表皮水分流失量增加，皮膚則出現(xiàn)干燥、脫屑。慢性濕疹在中醫(yī)學(xué)中屬于“濕瘡”范疇，根據(jù)其臨床表現(xiàn)辨證為血虛風(fēng)燥證。當(dāng)歸飲子出自《濟(jì)生方》，是治療血虛風(fēng)燥證皮膚病的代表方劑。錢軼雯等[2]研究證實(shí)，當(dāng)歸飲子能夠有效改善血虛風(fēng)燥型濕疹患者皮損狀態(tài)，減輕瘙癢程度。本實(shí)驗(yàn)通過建立血虛風(fēng)燥型皮炎-濕疹樣病變豚鼠模型，旨在探討當(dāng)歸飲子對(duì)表皮通透屏障功能的調(diào)控機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)健康雄性DH豚鼠32只，體重(350±20)g，購自陜西君行生物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(陜)2017-001。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心普通級(jí)環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度10%～25%,光照節(jié)律12L∶12D。本實(shí)驗(yàn)已通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(IACUC-20160218-076)。

1.2主要藥物 當(dāng)歸飲子組方：當(dāng)歸10 g、白芍10 g、川芎10 g、生地黃10 g、白蒺藜10 g、防風(fēng)10 g、荊芥10 g、何首烏5 g、黃芪5 g、炙甘草5 g、生姜3 g。飲片購自新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，由中藥師進(jìn)行藥材真?zhèn)舞b定。中藥常規(guī)煎煮2次，合并濾液，95 ℃水浴濃縮后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。氯雷他定?海南新世通制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20041886)。給藥劑量根據(jù)成人與豚鼠體表面積比例進(jìn)行換算。

1.3主要試劑及儀器 2，4-二硝基氯苯(上海古朵生物科技有限公司，批號(hào)：20191210)，丙酮(天津富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20190608)，豚鼠血清白細(xì)胞介素-4(IL-4，貨號(hào)：YX-E28700，批號(hào)：20200130)、白細(xì)胞介素-17(IL-17，貨號(hào)：YX-E28700，批號(hào)：20200130)、CD4+(貨號(hào)：YX-E28758，批號(hào)：20200130)、CD8+(貨號(hào)：YX-E28799，批號(hào)：20200130)、免疫球蛋白E(IgE，貨號(hào)：YX-E28996，批號(hào)：20200130)ELISA檢測(cè)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，蘇木素伊紅(HE)染色液(LEAGENE公司，批號(hào)：0611A20)。多功能皮膚測(cè)試儀(德國CK公司， MPA6/10型)，臺(tái)式低速離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司，SF-TDL-5C型)，分析天平(德國Sartorius公司，BL310/BL21S型)，電子天平(上海菁海儀器有限公司，DY15K型)，光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司，DM2500型)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1溶液的制備方法 致敏及激發(fā)溶液的制備:精密稱取2，4-二硝基氯苯3.50 g，用50 mL丙酮溶解，制成7%的2,4-二硝基氯苯丙酮溶液作為實(shí)驗(yàn)的致敏溶液；精密稱取2，4-二硝基氯苯0.10 g，用100 mL丙酮溶解，制成0.1%的2,4-二硝基氯苯丙酮溶液作為實(shí)驗(yàn)的激發(fā)溶液。

1.4.2動(dòng)物分組、造模及干預(yù) 豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、氯雷他定組和當(dāng)歸飲子組，每組8只。除正常組外，其余組參考文獻(xiàn)[3]方法造模：豚鼠背部脫毛3 cm×3 cm大小以暴露皮膚,實(shí)驗(yàn)第1天以7%致敏溶液100 μL外涂背部脫毛區(qū)致敏,第5天外涂0.1%激發(fā)溶液25 μL于豚鼠左耳內(nèi)側(cè)激發(fā)，每周重復(fù)上述操作1次,共致敏、激發(fā)各4次。造模4周結(jié)束后，豚鼠背部致敏區(qū)皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹、苔蘚樣變并伴明顯搔抓現(xiàn)象，左耳局部明顯潮紅或有少量白色細(xì)碎鱗屑提示模型建立成功。實(shí)驗(yàn)第29天開始，當(dāng)歸飲子組給予當(dāng)歸飲子水煎濃縮液6.82 g/kg(濃度1.36 g/mL)灌胃，氯雷他定組給予氯雷他定0.80 mg/kg(濃度0.16 mg/mL)灌胃，正常組和模型組給予相應(yīng)體積生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)14 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1皮膚組織病理觀察 灌胃結(jié)束后，取豚鼠背部致敏區(qū)皮膚組織(正常組取相應(yīng)背部皮膚組織)，甲醛固定，石蠟包埋,制成5 μm厚薄層切片，常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.2皮損評(píng)分 分別于造模結(jié)束當(dāng)日和灌胃結(jié)束當(dāng)日進(jìn)行皮損評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4]。紅斑：無為0分，輕微為1分，明顯紅斑無痂皮為2分，中度紅斑伴輕中度痂皮為3分，重度紅斑伴重度痂皮為4分；水腫：無為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分；抓痕：無為0分，有為1分?？傇u(píng)分為上述各項(xiàng)評(píng)分之和。

1.5.3皮膚角質(zhì)層含水量及經(jīng)表皮水分流失量檢測(cè) 分別于造模前、造模結(jié)束及灌胃結(jié)束當(dāng)日使用多功能皮膚測(cè)試儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4血清指標(biāo)檢測(cè) 灌胃結(jié)束后采用1%戊巴比妥鈉麻醉各組豚鼠，腹主動(dòng)脈取血約8 mL，3 000 r/min(離心半徑16 cm)離心15 min，取上清液置于-80 ℃冰箱中，待用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清IgE、IL-4、IL-17、CD4+、CD8+水平，操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組豚鼠皮膚組織形態(tài)比較 正常組豚鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)基本正常，皮膚表皮角質(zhì)層、顆粒層、棘細(xì)胞層及基底細(xì)胞層結(jié)構(gòu)完整，真皮層纖維排列整齊，未見水腫、出血及炎性細(xì)胞浸潤等病理改變；模型組豚鼠皮膚表皮角化過度，顆粒層、棘細(xì)胞層及基底細(xì)胞層增生，真皮淺層大量密集分布嗜酸性粒細(xì)胞，真皮乳頭水腫，纖維結(jié)締組織輕度增生；氯雷他定組豚鼠皮膚表皮角質(zhì)層輕度角化，棘細(xì)胞層增厚，真皮層少量炎性細(xì)胞浸潤；當(dāng)歸飲子組豚鼠皮膚表皮趨于正常，顆粒層增生，真皮層少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 正常組和皮炎-濕疹樣病變各組豚鼠皮損區(qū)皮膚組織HE染色表現(xiàn)

2.2各組豚鼠皮損評(píng)分比較 造模后，各造模組豚鼠皮損評(píng)分明顯高于正常組(P均<0.05)；灌胃結(jié)束后，模型組豚鼠皮損評(píng)分明顯高于正常組(P<0.05)，氯雷他定組和當(dāng)歸飲子組均明顯低于模型組(P均<0.05)，當(dāng)歸飲子組與氯雷他定組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 正常組和皮炎-濕疹樣病變各組豚鼠皮損評(píng)分比較分)

2.3各組豚鼠皮膚角質(zhì)層含水量比較 造模前，各組豚鼠皮膚角質(zhì)層含水量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。造模后，各造模組豚鼠皮膚角質(zhì)層含水量均明顯低于正常組(P均<0.05)，各造模組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃結(jié)束后，模型組豚鼠皮膚角質(zhì)層含水量明顯低于正常組(P<0.05)，氯雷他定組和當(dāng)歸飲子組均明顯高于模型組(P均<0.05)，且當(dāng)歸飲子組明顯高于氯雷他定組(P<0.05)。見表2。

表2 正常組和皮炎-濕疹樣病變各組豚鼠皮膚角質(zhì)層含水量比較

2.4各組豚鼠經(jīng)表皮水分流失量比較 造模前，各組豚鼠經(jīng)表皮水分流失量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。造模后，各造模組豚鼠經(jīng)表皮水分流失量均明顯高于正常組(P均<0.05)，各造模組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃結(jié)束后，模型組豚鼠經(jīng)表皮水分流失量明顯高于正常組(P<0.05)，氯雷他定組和當(dāng)歸飲子組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且當(dāng)歸飲子組豚鼠明顯低于氯雷他定組(P<0.05)。見表3。

表3 正常組和皮炎-濕疹樣病變各組豚鼠經(jīng)表皮水分流失量比較

2.5各組豚鼠血清IgE、IL-4、IL-17、CD4+、CD8+水平比較 模型組豚鼠血清IgE、IL-17、CD8+水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，血清IL-4、CD4+水平均明顯低于正常組(P均<0.05)；氯雷他定組和當(dāng)歸飲子組豚鼠血清IgE、IL-17、CD8+水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，但當(dāng)歸飲子組均明顯高于氯雷他定組(P均<0.05)；氯雷他定組和當(dāng)歸飲子組豚鼠血清IL-4、CD4+水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，但當(dāng)歸飲子組均明顯低于氯雷他定組(P均<0.05)。見表4。

表4 正常組和皮炎-濕疹樣病變各組豚鼠血清IgE、IL-4、IL-17、CD4+、CD8+水平比較

3 討 論

表皮通透屏障功能障礙常表現(xiàn)為皮膚水分過度流失導(dǎo)致皮膚外觀呈干燥脫屑狀態(tài)，同時(shí)促進(jìn)表皮增生以及某些炎癥因子的釋放[5]。周光教授從中醫(yī)角度分析認(rèn)為皮毛“疏泄”功能障礙和“潤澤”狀態(tài)改變?cè)谄つw病證候與病機(jī)方面具有普遍性和特征性[6]?；谂K腑營衛(wèi)脈絡(luò)表里相關(guān)整體性理論，諸多名家醫(yī)案立法與組方用藥在皮膚“疏泄”與“潤澤”立法方面有明顯的趨同性[7]。皮毛“疏泄”與“潤澤”功能是皮毛“衛(wèi)外”功能的具體反映形式和理論內(nèi)涵，也是中醫(yī)“皮毛微環(huán)境”的主要特征[8]。中醫(yī)皮毛“疏泄”與“潤澤”微環(huán)境功能與西醫(yī)學(xué)表皮通透屏障功能有趨同性，表皮通透屏障功能障礙是許多皮膚病的共性機(jī)制[9]。基于《內(nèi)經(jīng)》“皮毛生

腎”理論，皮毛與腎的滋養(yǎng)有密切聯(lián)系。一方面，腎精通過腎絡(luò)供給皮膚營養(yǎng)以濡養(yǎng)皮毛；另一方面，元?dú)馐菤庵?，衛(wèi)氣根源于腎，元?dú)獬渥?，皮膚衛(wèi)外功能正常。慢性濕疹以瘙癢為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)病主要因肝腎精血不足，經(jīng)絡(luò)不通，皮膚“疏泄”和“潤澤”功能失調(diào)，肌膚失于濡養(yǎng)以致血虛風(fēng)燥。

當(dāng)歸飲子具有滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血潤燥之功效。方中當(dāng)歸為君藥，配伍生地黃、白芍、川芎、何首烏補(bǔ)益肝腎，疏通經(jīng)絡(luò)，養(yǎng)血潤燥；荊芥、防風(fēng)、白蒺藜辛散透表，疏泄皮毛；黃芪益氣固表升陽，以助方中養(yǎng)血潤燥之藥達(dá)表，又可祛邪外出；甘草調(diào)和諸藥。諸藥配伍，補(bǔ)中有通，能夠?qū)⒏文I之精經(jīng)臟腑經(jīng)絡(luò)輸送至肌表以濡養(yǎng)皮毛，改善“皮毛微環(huán)境”。

本研究用2,4-二硝基氯苯建立皮炎-濕疹豚鼠模型，HE染色顯示皮膚表皮角質(zhì)層角化過度，顆粒層、棘細(xì)胞層及基底細(xì)胞層增生，真皮淺層有大量嗜酸性粒細(xì)胞，真皮乳頭水腫，纖維結(jié)締組織輕度增生；豚鼠皮損評(píng)分升高。當(dāng)歸飲子組干預(yù)后，HE染色顯示皮膚表皮角質(zhì)層角化程度趨于正常，真皮層嗜酸性粒細(xì)胞浸潤明顯減輕；豚鼠皮損評(píng)分顯著降低。提示當(dāng)歸飲子可以有效改善血虛風(fēng)燥證皮炎-濕疹樣豚鼠的皮膚狀態(tài)及皮膚組織病理改變。

目前研究表明濕疹的發(fā)病、加重及預(yù)后延遲與表皮通透屏障功能障礙有密切聯(lián)系[1]。皮膚角質(zhì)層含水量及經(jīng)表皮水分流失量是非侵入性測(cè)定表皮通透屏障功能的主要指標(biāo)，能夠靈敏反映皮膚屏障功能[10]。皮膚角質(zhì)層含水量和經(jīng)表皮水分流失量與濕疹嚴(yán)重程度相關(guān)[11]，經(jīng)表皮水分流失量越高，說明角質(zhì)層水量丟失越多，含水量越少，皮膚則呈干燥、脫屑狀態(tài)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸飲子組豚鼠經(jīng)表皮水分流失量明顯低于模型組，皮膚角質(zhì)層含水量明顯高于模型組，結(jié)合皮膚病理和皮膚狀態(tài)變化，推測(cè)當(dāng)歸飲子可以通過改善皮膚組織形態(tài)，從而減少經(jīng)表皮水分散失，達(dá)到修復(fù)表皮通透屏障的作用。

隨著對(duì)濕疹的研究深入，發(fā)現(xiàn)表皮通透屏障功能和機(jī)體免疫平衡有密切關(guān)系[13]。初始T細(xì)胞經(jīng)刺激可分化為CD4+T細(xì)胞亞群和CD8+T細(xì)胞亞群，兩者之間相互制約、協(xié)調(diào)來維持人體免疫穩(wěn)態(tài)。若T淋巴細(xì)胞亞群比例失衡會(huì)導(dǎo)致免疫功能紊亂，血管擴(kuò)張、血管壁通透性增加，從而產(chǎn)生皮炎-濕疹樣病理改變[14]。CD4+T細(xì)胞又可分化為Th1、Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞。Th1/Th2的平衡失調(diào)是濕疹發(fā)生發(fā)展的原因之一，Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2細(xì)胞分泌IL-4等介導(dǎo)體液免疫[15]。Th17/Treg的平衡失調(diào)也可能是濕疹發(fā)病的另一重要原因[16]。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17細(xì)胞因子，IL-17刺激促炎性細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)，增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞活性，活化中性粒細(xì)胞，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。IgE 是過敏性疾病的重要標(biāo)志物，其可直接作用并誘導(dǎo)Th2細(xì)胞活化分泌IL-4，IL-4又可進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組豚鼠血清IL-4、CD4+明顯降低，IgE、IL-17、CD8+明顯升高；當(dāng)歸飲子組血清IL-4、CD4+明顯高于模型組，IgE、IL-17、CD8+明顯低于模型組。表明當(dāng)歸飲子可調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群比例和IL-4、IL-17細(xì)胞因子水平，恢復(fù)機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)；可降低血清IgE水平，達(dá)到類抗過敏作用。

綜上所述，當(dāng)歸飲子可通過改善皮膚組織形態(tài)而減少經(jīng)表皮水分散失，可降低血清IgE水平達(dá)到類抗過敏效果，可改善CD4+、CD8+平衡狀態(tài)及調(diào)節(jié)血清IL-4、IL-17細(xì)胞因子來修復(fù)表皮通透屏障，從而達(dá)到改善“皮毛微環(huán)境”狀態(tài)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。