郭海清，王樹(shù)東，黃醫(yī)明，張勝楠

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847)

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種多見(jiàn)于中老年群體、與不恰當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相關(guān)的退行性關(guān)節(jié)軟骨改變的疾病，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬、腫脹、上下樓梯痛等，甚至致殘，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量[1-2]。軟骨細(xì)胞維持著軟骨的平衡，其淺層直接包附著關(guān)節(jié)，在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病初期，軟骨細(xì)胞負(fù)責(zé)的骨骼縱向骨生長(zhǎng)失衡，進(jìn)而誘發(fā)軟骨下骨、骨骼生物力學(xué)失衡，致使關(guān)節(jié)軟骨局部炎癥的發(fā)生，形成骨關(guān)節(jié)炎[3]。因此，現(xiàn)有的對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的研究多從關(guān)節(jié)軟骨和骨骼生物力學(xué)著手。然而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎除了膝關(guān)節(jié)置換術(shù)之外并沒(méi)有徹底根除的治療方案，雖然手術(shù)療法有效，但有創(chuàng)且費(fèi)用昂貴，故使用范圍小，臨床多以止痛、增強(qiáng)關(guān)節(jié)活動(dòng)度等改善癥狀治療為主。筋針療法和關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)分別為中西醫(yī)領(lǐng)域中治療膝骨關(guān)節(jié)炎較為常見(jiàn)、方便的外治療法，可以改善膝關(guān)節(jié)的生物力學(xué)異常和保護(hù)軟骨。前期研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路參與軟骨細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化、凋亡，在骨發(fā)育和骨重建中起雙重作用[4-6]。本研究試圖從Notch信號(hào)通路角度探究筋針結(jié)合關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)干預(yù)對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中Notch2和Jagged-1表達(dá)的影響，明確中西醫(yī)外治法聯(lián)用治療膝骨關(guān)節(jié)炎的可行性和可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 26只普通級(jí)大耳白兔，雌雄各半，體重(2.5±0.5)kg，月齡4～6個(gè)月，購(gòu)自沈陽(yáng)騰華生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)2018-0002。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心科研倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn) (21000042020050)，實(shí)驗(yàn)期間在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心單籠單只飼養(yǎng)，環(huán)境濕度為50%～60%，環(huán)境溫度為(23±3)℃,實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循倫理道德標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要試劑及儀器 兔源Notch2多克隆抗體、兔源Jagged-1多克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗(北京博奧森生物科技有限公司)；10%水合氯醛溶液、SDS-PAGE、PVDF膜、脫脂牛奶、HRP酶、異丙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、液氮、10%中性甲醛溶液及二甲苯、中性樹(shù)膠(均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供)；鹽酸氨基葡萄糖(奧泰零,生產(chǎn)批號(hào)：6200376)；4%多聚甲醛固定液(飛凈生物科技有限公司)；注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán))；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(泰盟科技，BL-420S)；組織脫水機(jī)、組織包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、染色機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMpUS公司)；一次性無(wú)菌針灸針(益立牌，0.25 mm×40 mm)；超低溫冰箱(日本SANYO)；EPS300電泳儀(天能科技)；SHA-B型恒溫水浴振蕩器(常州國(guó)華儀器設(shè)備廠)；蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)GE)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Alpha)等；手術(shù)剪、手術(shù)刀、持針鉗、縫合線、手術(shù)針、無(wú)菌注射器、碘伏消毒液等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 26只兔采用兔用飼料和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取6只兔作為空白組，剩余20只兔用Hulth法[7]造模：造模前禁食禁水8～16 h，用10%水合氯醛沿兔的耳門(mén)靜脈緩慢注射麻醉后，將兔仰臥位固定，剔除左膝周?chē)l(fā)，持碘酒棉球于左膝關(guān)節(jié)大面積消毒，沿髕韌帶外側(cè)做長(zhǎng)約2.5 cm切口，暴露關(guān)節(jié)面，確認(rèn)切斷其內(nèi)側(cè)副韌帶、前交叉韌帶，盡量不破壞關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)軟骨，止血后消毒，逐層縫合封皮。術(shù)后腹腔注射青霉素40萬(wàn)IU/d，連續(xù)1周，以防感染；同時(shí)術(shù)后不固定患肢，每天驅(qū)趕兔活動(dòng)縮短造模時(shí)間，每天30 min，3周后隨機(jī)處死2只兔，以肉眼觀察兔關(guān)節(jié)軟骨邊緣粗糙無(wú)光澤，呈現(xiàn)鈣化趨勢(shì)，軟骨表面有裂紋及潰瘍糜爛為造模成功。將造模成功后的18只兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、氨糖組和筋針結(jié)合松動(dòng)術(shù)組，每組6只?？瞻捉M和模型組正常飼養(yǎng)；氨糖組每只兔給予鹽酸氨基葡萄糖20 mg/(kg·d)灌胃(參照臨床70 kg體重患者日服量[8]折算給藥量)，每日1次，連續(xù)6周。筋針結(jié)合松動(dòng)術(shù)組先根據(jù)《中國(guó)經(jīng)筋學(xué)》[9]的經(jīng)筋查體法和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位的標(biāo)準(zhǔn)化定位方法[10]循經(jīng)筋辨證出現(xiàn)的結(jié)筋病灶點(diǎn)，選取足三陽(yáng)、足三陰經(jīng)筋點(diǎn)2～3個(gè)(一般分布在髕內(nèi)下、脛骨內(nèi)髁、髕下、承山次、委陽(yáng)次等附近)行針刺，針刺后進(jìn)行關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)，重點(diǎn)對(duì)脛腓關(guān)節(jié)前后向和后前向滑動(dòng)、對(duì)髕骨關(guān)節(jié)水平擺動(dòng)、對(duì)脛股關(guān)節(jié)屈伸或旋轉(zhuǎn)、對(duì)膝關(guān)節(jié)分離牽引，每日1次，每次針刺和松動(dòng)術(shù)各15 min，連續(xù)6周。

1.4標(biāo)本采集 干預(yù)6周結(jié)束后，各組兔禁食禁水處理24 h，空氣栓塞法處死，取膝關(guān)節(jié)周?chē)浌墙M織,放于4%多聚甲醛固定液中-80 ℃低溫冰箱冷凍保存。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1軟骨細(xì)胞中Notch2、Jagged-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)：①將樣品加熱至95 ℃，持續(xù)5～10 min，放置于含有還原劑的樣品緩沖液中。將凝膠放入電泳槽，添加PBS緩沖液，確保槽的上方已經(jīng)覆蓋，在第一條泳道做標(biāo)記，然后上樣樣品，完成后添加電泳緩沖液，將蓋子蓋在電泳槽上。啟動(dòng)電源將凝膠轉(zhuǎn)移到下方。②將凝膠從槽中移除并從箱中拿出，切割上樣孔和凝膠底部并將凝膠放入轉(zhuǎn)移緩沖液中。將膜和凝膠放在海綿和濾紙之間，疊放備用，用小滾筒移除所有介于膜和膠之間的氣泡，移至含有緩沖液的轉(zhuǎn)移槽中，加水使系統(tǒng)冰涼并蓋上蓋子轉(zhuǎn)移。③移除，采用5%的脫脂牛奶將膜封閉放置4 ℃冰箱過(guò)夜，同樣的條件下培養(yǎng)一抗。第2天取出稀釋一抗2次并沖洗，倒掉后耦聯(lián)二抗孵育膜，同樣的方法稀釋二抗并清洗3次，每次5 min。最后與高靈敏度ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)后成像。

1.5.2軟骨細(xì)胞中Notch2、Jagged-1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光PCR法檢測(cè)：TriZol從培養(yǎng)細(xì)胞中提取RNA(1 mL)，用一次性針管吹吸幾次，室溫孵育5 min。TriZol提取流程：每次使用1 mL加入0.2 mL氯仿，強(qiáng)烈震動(dòng)15 s，室溫孵育3 min。10 000×g 4 ℃離心15 min后，樣品分3層。吸取上層無(wú)色水相于新的離心管中，每使用1 mL TriZol加入500 μL異丙醇，室溫孵育5 min。10 000×g 4 ℃離心10 min，在管底形成膠狀沉淀。棄上清，加1 mL 75%乙醇，劇烈渦旋。7 500×g 4 ℃離心5 min。棄上清，室溫晾干沉淀。沉淀溶于50～100 μL RNA溶液中。55～60 ℃孵育10 min，保存樣本于-80 ℃低溫冰箱以備使用。RNA反轉(zhuǎn)錄：計(jì)算RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄出cDNA，以cDNA作為模板加入Notch2的引物(上游5’-ACCGTAAGAGGATAACAGAAA-3’，下游3’-AGGAAGGCTACAATCACAAC- 5’)和Jagged-1的引物(上游5’-GTGTCAGTCTTCGCCTTGTGC-3’，下游3’-TCGCTGCCCTTTGTGGTGC-5’)，以β-actin(上游5’-CCCATCTACGAGGGCTACG-3’，下游3’-GGAAGGAGGGCTGGAACA-5’)作為內(nèi)參。采用PCR熱循環(huán)參數(shù)為95 ℃變性40 s，然后冷卻至55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，結(jié)果分析采用2-△△Ct法計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Notch2、Jagged-1蛋白表達(dá)情況 模型組軟骨細(xì)胞中Notch2、Jagged-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組(P均<0.05)，氨糖組和筋針結(jié)合松動(dòng)術(shù)組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且筋針結(jié)合松動(dòng)術(shù)組均明顯低于氨糖組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和膝骨關(guān)節(jié)炎各組兔軟骨細(xì)胞中Notch2和Jagged-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.2各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Notch2、Jagged-1 mRNA表達(dá)情況 模型組軟骨細(xì)胞中Notch2、Jagged-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白組(P均<0.05)，氨糖組和筋針結(jié)合松動(dòng)術(shù)組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且筋針結(jié)合松動(dòng)術(shù)組均明顯低于氨糖組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 空白組和膝骨關(guān)節(jié)炎各組兔軟骨細(xì)胞中Notch2和Jagged-1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

隨著社會(huì)老齡化現(xiàn)象日益加劇，膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率也在逐年升高[11]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)出現(xiàn)膝骨關(guān)節(jié)炎癥狀的人群約占8.1%，以女性為主，多分布于西部地區(qū)[12]。因此，改善膝骨關(guān)節(jié)炎患者的癥狀，減少、避免該病致殘至關(guān)重要。但手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)性高、費(fèi)用昂貴，口服藥物毒副作用大，由此外治療法優(yōu)勢(shì)凸顯。

中醫(yī)學(xué)及經(jīng)筋理論對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎有獨(dú)到見(jiàn)解，認(rèn)為本病與“虛、邪、瘀”夾雜而致相關(guān)，發(fā)病由筋至骨，逐漸形成?！跋樽诮钪保闳?yáng)、足三陰經(jīng)筋結(jié)聚于此，膝部更易受邪侵襲形成病所[13]。素體感邪，“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，邪阻脈絡(luò)，致氣血運(yùn)行不暢，《醫(yī)林改錯(cuò)》認(rèn)為“痹有瘀血”，久而累及骨?！端貑?wèn)·上古天真論》曰：“女子七歲……五七，陽(yáng)明脈衰，面始焦，發(fā)始?jí)櫋煞虬藲q……五八，腎氣衰，發(fā)墮齒槁?！比酥林心辏K腑功能衰退，肝腎不足，氣、血、筋、骨、髓不得以充分濡養(yǎng)，氣虛、血瘀與筋骨失養(yǎng)相互影響反復(fù)加重病情，致使膝骨關(guān)節(jié)炎愈演愈烈?！稄埵厢t(yī)通》中“膝為筋之府……膝痛無(wú)有不因肝腎虛者，虛則風(fēng)寒濕氣襲之”也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)從現(xiàn)代生物力學(xué)與解剖學(xué)角度出發(fā)，垂直或平行關(guān)節(jié)面施行手法，牽動(dòng)關(guān)節(jié)的生理及附屬運(yùn)動(dòng)，可改善膝關(guān)節(jié)周?chē)伤念^肌、腘繩肌、脛腓關(guān)節(jié)、脛股關(guān)節(jié)等之間的力學(xué)平衡，促進(jìn)關(guān)節(jié)液流動(dòng)，營(yíng)養(yǎng)軟骨，恢復(fù)關(guān)節(jié)微小錯(cuò)位，提高位置覺(jué)和運(yùn)動(dòng)覺(jué)感知[14-16]。松動(dòng)術(shù)利用手法技術(shù)被動(dòng)活動(dòng)患者的肌肉和骨關(guān)節(jié)，將松解、牽拉和關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)有機(jī)結(jié)合，與經(jīng)筋理論中的松解結(jié)筋病灶點(diǎn)、舒筋通絡(luò)、筋骨并重的思想相一致。而肌肉、筋膜、韌帶、軟骨和關(guān)節(jié)、軟骨下骨等又分別與經(jīng)筋理論中的“筋”“骨”相呼應(yīng)，針刺也已被證實(shí)可以改善患者的本體感覺(jué)功能，增強(qiáng)肌肉力量，提高運(yùn)動(dòng)控制水平，調(diào)節(jié)筋骨恢復(fù)平衡[17]。并已有相關(guān)研究證實(shí)針刺可降低膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中一氧化氮水平和血清Ⅱ型膠原C端肽(CTX-Ⅱ)水平，抑制炎性反應(yīng)和軟骨細(xì)胞凋亡，保護(hù)軟骨[18-19]。

Notch信號(hào)通路參與骨代謝，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能,特別是Notch2與破骨細(xì)胞直接相關(guān)，其表達(dá)增加直接導(dǎo)致骨吸收增加，骨骼系統(tǒng)被破壞[20]。Jagged-1是最有可能調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的配體，與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系最為密切，在膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中大量表達(dá)，與膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變呈正相關(guān)關(guān)系[21-22]。Notch2和Jagged-1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，因此關(guān)系到軟骨細(xì)胞的分化[21，23]，二者大量表達(dá)，使得成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡機(jī)制被破壞，骨再生和骨吸收失衡，軟骨細(xì)胞分化不能正常運(yùn)行，軟骨發(fā)生退變，引起或加重骨關(guān)節(jié)炎。

本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定膝骨關(guān)節(jié)炎兔模型軟骨細(xì)胞中Notch2、Jagged-1蛋白和mRNA 表達(dá)情況，結(jié)果顯示筋針結(jié)合關(guān)節(jié)松動(dòng)術(shù)療法和鹽酸氨基葡萄糖都可以下調(diào)Notch2、Jagged-1蛋白和mRNA表達(dá)，恢復(fù)骨骼系統(tǒng)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的平衡，從而保護(hù)軟骨及骨，為臨床治療提供了一定依據(jù)。但Notch信號(hào)通路是一個(gè)多靶點(diǎn)的復(fù)雜調(diào)控通路系統(tǒng)，Notch2、Jagged-1的其他作用及與骨骼系統(tǒng)的關(guān)系有待于進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。