李慧雪 黃振 周宇明 暴怡雪 姚姿婷 張木清 姚偉

摘 ?要：甘蔗鐮孢菌（Fusarium sacchari）是引起毀滅性病害甘蔗梢腐?。╯ugarcane pokkah boeng disease， PBD）的主要病原菌之一。病原菌分泌的效應(yīng)蛋白在病原與植物互作中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本研究基于課題組前期甘蔗鐮孢菌全基因測(cè)序數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)基因特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到一個(gè)新的含CBM4_9結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)蛋白基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步探索。序列分析表明Fs11724基因開放閱讀框822 bp，編碼273個(gè)氨基酸，分子量為28.24 kDa，理論pI值為4.29，親水性平均系數(shù)–0.072，屬于親水性分泌蛋白;通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)證實(shí)Fs11724抑制由BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡，表明Fs11724具有潛在抑制寄主防御反應(yīng)的毒性功能;同時(shí)，利用酵母分泌系統(tǒng)對(duì)其編碼蛋白信號(hào)肽的分泌功能進(jìn)行驗(yàn)證，確定該基因編碼蛋白為典型分泌蛋白;qRT-PCR結(jié)果分析表明Fs11724在甘蔗鐮孢菌侵染前、后期上調(diào)表達(dá)，表達(dá)量在168 hpi達(dá)到峰值。該研究表明Fs11724編碼蛋白為甘蔗鐮孢菌F. sacchari的一個(gè)效應(yīng)蛋白，其信號(hào)肽具有分泌功能，并且可以在非寄主植物煙草上抑制BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，在真菌侵染植物過(guò)程中顯著表達(dá)，可能在調(diào)控植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究病原–甘蔗互作，揭示甘蔗鐮孢菌發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘蔗;Fusarium sacchari;CBM;效應(yīng)蛋白;qRT-PCR

中圖分類號(hào)：S432.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identification and Functional Analysis of Carbohydrate Binding Module Effector Gene Fs11724 of Fusarium sacchari

LI Huixue1，2， HUANG Zhen1，3*， ZHOU Yuming1，2， BAO Yixue1，3， YAO Ziting1，2， ZHANG Muqing1，3**， YAO Wei1，2，3**

1. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning， Guangxi 530004， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biology， Nanning， Guangxi 530004， China; 3. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China

Abstract： Fusarium sacchari is one of the main pathogens causing the devastating disease （sugarcane pokkah boeng disease， PBD）. Effector proteins secreted by pathogens play an important role in the interaction between pathogens and plants. In this study， the gene-specific primer was designed based on the previous sequencing data of the whole genome of F. sacchari. A new effector protein gene containing the CBM4_9 domain （carbohydrate-binding module， CBM） was amplified by reverse transcription PCR （RT-PCR）. Subsequently， we conducted a preliminary exploration of its function. Sequence analysis showed that Fs11724 contained a 822 bp open reading frame （ORF） encoding a protein of 273 amino acids residues with predicted molecular mass of 28.24 kDa and theoretical isoelectric point （pI） of 4.29. Through hydrophobicity analysis by ProtParam， the grand average of hydropathicity （GRAVY） of the protein encoded by Fs11724 was –0.072， which was less than zero， indicating that the protein encoded by Fs11724 might be a hydrophilic secreted protein. The toxic function of Fs11724 gene was identified by Agrobacterium-mediated transient expression system in Nicotiana benthamiana， The result showed that Fs11724 suppressed BAX-triggered programmed cell death in N. benthamiana leaves， indicating its potential toxic function on inhibiting host plant defense response. At the same time， the secretory function of the predicted signal peptide of Fs11724 was verified by yeast secretory system， as a result， the protein encoded by Fs11724 was identified as a typical secretory protein. In addition， the gene expression level was monitored by quantitative real-time PCR （qRT-PCR） experiments. The results and analysis of qRT-PCR indicated that the expression of Fs11724 showed the overall upregulated trend not only at the early phase of F. sacchari infestation but also at the late phase of F. sacchari infestation. And the gene expression reached the highest expression level at 168 hours post inoculation （hpi）. In conclusion， our results in this study suggested that the protein encoded by Fs11724 was an extracellular effector protein of F. sacchari. The signal peptide of this protein had secretory function. In addition， Fs11724 could inhibit BAX-induced programmed cell death in non-host plant N. benthamiana and significantly expressed in the process of pathogenic fungi infecting plants. Therefore， it was speculated that Fs11724 might play a role in regulation of plant immune response. The results would lay a foundation for further research on pathogen-sugarcane interaction and revealing the molecular pathogenesis of F. sacchari.

Keywords： sugarcane; Fusarium sacchari; CBM; effector protein; qRT-PCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.005

甘蔗（Saccharum spp.）是我國(guó)最重要的糖料作物，蔗糖產(chǎn)量占全國(guó)食糖總量的90%以上[1]。由多種鐮孢菌引起的甘蔗梢腐?。╬okkah boeng disease， PBD）是影響我國(guó)甘蔗生產(chǎn)的重要真菌性病害，近幾年該病害在中國(guó)蔗區(qū)呈明顯加重趨勢(shì)[2]，尤其云南蔗區(qū)一些高感品種梢腐病的爆發(fā)導(dǎo)致甘蔗減產(chǎn)30.2%～48.5%，蔗糖分下降2.63%～ 5.21%[3]。Fusarium sacchari CNO-1的最適生長(zhǎng)溫度為28～32℃，高溫高濕氣候促使其產(chǎn)生大量分生孢子而引發(fā)PBD，它不僅是夏季引起PBD的主要病原菌[4]，同時(shí)也引發(fā)甘蔗鐮刀菌萎蔫病（sugarcane Fusarium wilting disease）[5]，嚴(yán)重影響蔗莖產(chǎn)量與含糖量，給甘蔗產(chǎn)業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。深入研究甘蔗鐮孢菌與甘蔗互作、調(diào)控甘蔗鐮孢菌侵染及致病的分子機(jī)制對(duì)有效防治PBD具有重要意義。

在植物與病原菌的長(zhǎng)期相互作用中，植物進(jìn)化出雙層防御系統(tǒng)[6]。植物利用細(xì)胞膜表面模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別某些病源性分子，如病原體相關(guān)分子模式（pathongen- associated molecular patterns，PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）觸發(fā)第一層防御反應(yīng)，即PTI（PAMP- triggered immunity）反應(yīng)[7]。其中幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，也是進(jìn)化相對(duì)保守的PAMPs，幾丁質(zhì)酶可被植物分泌到質(zhì)外體，降解為幾丁質(zhì)低聚糖，被植物表面PRRs識(shí)別后激活PTI反應(yīng)[8];除此之外，典型DAMPs如細(xì)胞壁降解產(chǎn)物胞外ATP（eATP）和植物激發(fā)子肽（Pep1），可作為內(nèi)源信號(hào)分子激發(fā)植物類PTI反應(yīng)[9-10]。病原菌為克服植物基礎(chǔ)防御，通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白到植物細(xì)胞質(zhì)外體或者細(xì)胞質(zhì)內(nèi)干擾或者破壞寄主PTI以增強(qiáng)自身毒力，提高適應(yīng)性。植物也在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生特異的抗性基因（resistance，R）來(lái)識(shí)別病原菌效應(yīng)蛋白，由此觸發(fā)第二層防御反應(yīng)，即ETI（effector-triggered immunity）反應(yīng)[6]。ETI最明顯特征之一是引發(fā)植物超敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR），即導(dǎo)致病原體攻擊部位的細(xì)胞快速死亡，以此限制病原體傳播[11]。植物細(xì)胞壁是植物抵抗病原菌的第一道屏障，植物病原菌通過(guò)分泌碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）降解植物細(xì)胞壁，導(dǎo)致植物受害;而植物則通過(guò)釋放植物細(xì)胞壁降解酶的抑制物質(zhì)來(lái)減弱植物細(xì)胞壁的降解，以抵御病原菌的入侵[12]。病原真菌為了保護(hù)自身細(xì)胞壁主要成分幾丁質(zhì)不被植物幾丁質(zhì)酶所識(shí)別和降解，一類本身沒有催化活性但具有碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding modules，CBMs）的真菌效應(yīng)蛋白質(zhì)，分泌到質(zhì)外體與幾丁質(zhì)或幾丁質(zhì)寡糖結(jié)合，通過(guò)靶向和促進(jìn)與底物的長(zhǎng)時(shí)間相互作用增強(qiáng)真菌CAZyme活性或者協(xié)助真菌逃逸寄主植物的識(shí)別，屬于質(zhì)外體效應(yīng)蛋白，也是抵御PTI相關(guān)酶的“抑制劑”[12-14]。如番茄葉霉菌（Cladosporium fulvum）的CBM14效應(yīng)蛋白（Avr4）分泌到植物胞外空間與幾丁質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)黃枝孢霉成功致病[15];黃枝孢霉的CBM50效應(yīng)蛋白Ecp6（含LysM模序的效應(yīng)蛋白）通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合幾丁質(zhì)寡糖，抑制幾丁質(zhì)觸發(fā)的植物免疫反應(yīng)[16]。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）效應(yīng)蛋白Slp1、蘿卜炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）效應(yīng)蛋白ChELP1和ChELP2均含有LysM模序（CBM50），通過(guò)阻斷幾丁質(zhì)和植物膜受體的結(jié)合，從而協(xié)助病原菌逃避幾丁質(zhì)觸發(fā)的PTI反應(yīng)[17-18]。非苜蓿輪枝菌（Verticillium nonalfalfae）的效應(yīng)蛋白VnaChtBP含CBM18結(jié)合模塊，不僅能保護(hù)真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)免受宿主幾丁質(zhì)酶的水解，也能螯合幾丁質(zhì)寡聚體逃逸幾丁質(zhì)觸發(fā)的宿主植物免疫識(shí)別[19]。可見，病原真菌通過(guò)分泌含CBMs的效應(yīng)蛋白保護(hù)幾丁質(zhì)不被寄主免疫受體識(shí)別或通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合幾丁質(zhì)寡聚復(fù)合物可能成為病原真菌逃逸幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫反應(yīng)的一種普遍策略。在最近的研究中我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）CBM1效應(yīng)蛋白基因（VdCBM1）具有抑制寄主免疫反應(yīng)的功能，并協(xié)同糖苷水解酶共同操控寄主先天免疫反應(yīng)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)病原碳水化合酶類通過(guò)偶聯(lián)CBM1結(jié)構(gòu)域自我調(diào)控免疫反應(yīng)協(xié)助病原侵染的進(jìn)化機(jī)制[20]。因此，推測(cè)CBM效應(yīng)蛋白在病原-植物互作中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的CBM效應(yīng)蛋白基因被挖掘，如上所述的一些CBM類效應(yīng)蛋白也相繼在不同的病原真菌中被鑒定，但總體來(lái)說(shuō)CBM效應(yīng)蛋白作為非酶蛋白，其在植物免疫中的功能及作用機(jī)制還是知之甚少。

目前對(duì)于甘蔗鐮孢菌引起的發(fā)病機(jī)制、甘蔗與鐮孢菌的互作、甘蔗參與鐮孢菌病理反應(yīng)的重要功能基因的挖掘等基礎(chǔ)研究鮮有報(bào)道。本研究基于課題組前期甘蔗鐮孢菌基因組數(shù)據(jù)中獲得的分泌蛋白序列（未公布），通過(guò)生物信息學(xué)分析，以致病菌F. sacchari RNA為模板，通過(guò)RT-PCR克隆得到1個(gè)含碳水化合物結(jié)合模塊CBM4_9的候選效應(yīng)蛋白基因，并從煙草瞬時(shí)表達(dá)、信號(hào)肽分泌功能、基因表達(dá)特征等3個(gè)方面對(duì)其功能進(jìn)行初步分析，以確定其在甘蔗鐮孢菌侵染過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步揭示甘蔗與病原菌互作的分子機(jī)理奠定重要的理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料 ?供試甘蔗品種為廣西大學(xué)培育的‘中蔗1號(hào)’[21]，該品種為梢腐病易感品種，采自扶綏甘蔗種植基地半年蔗莖段，于廣西大學(xué)校內(nèi)溫室大棚桶栽，長(zhǎng)至5葉期時(shí)用于接種實(shí)驗(yàn);供試煙草（Nicotiana benthamiana）由本實(shí)驗(yàn)室提供，于25℃，60%濕度條件下溫室培養(yǎng)，光暗時(shí)間L∶D=10∶14。

1.1.2 ?菌株及載體 ?甘蔗鐮孢菌Fusarium sacchari由本實(shí)驗(yàn)室分離純化，于PDA培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng);大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，于LB培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng);農(nóng)桿菌GV3101（pJIC SA_Rep），購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司，于LB培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng);酵母菌株YTK12，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉文德老師饋贈(zèng)，30℃條件下恒溫培養(yǎng)。PVX病毒載體由西北農(nóng)林科技大學(xué)康振生院士饋贈(zèng);載體pSUC2，mg87-pSUC2，Avr1b-pSUC2由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉文德老師饋贈(zèng)。

1.1.3 ?主要試劑 ?TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript? RT reagent Kit （Perfect Real Time）、TB Green? Premix Ex Taq? II 購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit、pEASY?- Blunt Zero Cloning Kit購(gòu)自北京全式金生物;Taq酶、高保真酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit T2001（Zymo Research）、卡那霉素、慶大霉素、利福平、抗霉素A購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司;CMD-W、YPRAA復(fù)合培養(yǎng)基購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司;LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、YPDA均按照常規(guī)配方配制。

1.2 ?方法

1.2.1 ?生物信息學(xué)分析 ?利用在線軟件ExPASy- Proparam（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)Fs11724編碼蛋白氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析。參考真菌效應(yīng)蛋白預(yù)測(cè)方法[22]，利用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線預(yù)測(cè)是否含有信號(hào)肽并確定信號(hào)肽序列位置;TMHMM Server 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/ser?vices/TMHMM/）在線預(yù)測(cè)有無(wú)跨膜螺旋;PredGPI（http：//gpcr2.biocomp. unibo.it/predgpi/pred.htm）在線預(yù)測(cè)是否含有GPI錨定位點(diǎn);利用在線軟件TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ser-vices/TargetP-1.1/index.php）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用Conserved Domain Search（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov）在線預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 ?目的基因克隆及載體構(gòu)建 ?根據(jù)甘蔗鐮孢菌基因組中獲得分泌蛋白的cDNA序列，利用在線軟件CE Design（http：//www.vazyme.com）設(shè)計(jì)Fs11724基因的ORF框無(wú)縫克隆引物，結(jié)合NCBI Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/）檢測(cè)引物特異性（引物序列見表1）。以實(shí)驗(yàn)室保存的F. sacchari RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以特異性引物Fs11724-PVXF/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段，連接至pEASY克隆載體（全式金），挑取陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序驗(yàn)證。以限制性內(nèi)切酶Cla Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切PVX載體，實(shí)現(xiàn)載體線性化，利用無(wú)縫克?。╥n-fusion cloning）技術(shù)按照pEASY?-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit連接目的基因和PVX載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1，提取質(zhì)粒后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 ?農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn) ?將PVX空載及PVX重組載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，利用基因特異性引物檢測(cè)陽(yáng)性農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在含有50 μg/mL Kan，20 μg/mL Rif，50 μg/mL Gen的LB培養(yǎng)液中，28℃，220 r/min培養(yǎng)2 d。取10 mL菌液于50 mL滅菌離心管中，4000 r/min離心4 min收集菌體，以10 mL 10 mmol/L MgCl2洗滌菌體3次，最后用10 mmol/L MgCl2懸浮菌體，并調(diào)節(jié)OD600至0.4～0.5，懸浮液于28℃暗適應(yīng)2 h后進(jìn)行侵染。選用4～6周的煙草，用去掉針頭的一次性無(wú)菌注射器在葉片背面輕壓滲透注射。將攜帶PVX空載及含F(xiàn)s11724基因的農(nóng)桿菌懸浮液分別滲透注入，注射范圍用黑色記號(hào)筆進(jìn)行標(biāo)記。24 h后，將攜帶BAX基因的農(nóng)桿菌懸浮液注射到同一位點(diǎn)，滲透注射后的煙草避免燈光直射，7 d后觀察癥狀并拍照，期間注意觀察葉片癥狀變化。

1.2.4 ?Fs11724信號(hào)肽分泌功能驗(yàn)證 ?采用酵母信號(hào)肽篩選（yeast signal peptide screen， YSST）和化學(xué)催化法（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride， TTC）驗(yàn)證Fs11724信號(hào)肽的分泌功能[23-24]。以突變型酵母菌株YTK12作為轉(zhuǎn)化菌株，其缺失蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC2及色氨酸合成酶基因;載體pSUC2T7M130RI（pSUC2）含有色氨酸合成酶基因，以及1個(gè)缺失信號(hào)肽和起始密碼子ATG的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC2，只有插入具有分泌功能的基因或片段時(shí)，缺失的SUC2基因才能被啟動(dòng)表達(dá)并分泌到培養(yǎng)基中，將蔗糖或者棉籽糖轉(zhuǎn)化為酵母生長(zhǎng)所需的葡萄糖。根據(jù)在線軟件SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和SMART（http：//smart.embl.de/）預(yù)測(cè)Fs11724編碼蛋白的信號(hào)肽序列，設(shè)計(jì)特異性引物Fs11724 SP-pSUC2F/R（表1）擴(kuò)增信號(hào)肽序列，連接至EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切的pSUC2載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1，提取質(zhì)粒測(cè)序。利用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit T2001（Zymo Research）制備酵母感受態(tài)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母菌株YTK12，挑取在以蔗糖為碳源的CMD-W培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆，在以棉籽糖為碳源的YPRAA培養(yǎng)基上劃線驗(yàn)證信號(hào)肽的分泌功能。同時(shí)將陽(yáng)性克隆接種于10 mL YPDA培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)2 d;取1.5 mL菌液，12 000 r/min離心30 s，ddH2O洗滌菌體2次，最終在750 μL ddH2O懸浮菌體里加入250 μL 10 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.7），500 μL 10%蔗糖溶液，37℃孵育10 min;12 000 r/min離心30 s，取200 μL上清液加1.8 mL 0.1% TTC靜置10 min，觀察顏色變化，拍照保存。Avr1b是大豆疫霉中的分泌型效應(yīng)蛋白，其信號(hào)肽具有分泌活性，作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照;Mg87是稻瘟菌中的非分泌蛋白，其信號(hào)肽沒有分泌活性，作為本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照[25]。若預(yù)測(cè)的信號(hào)肽具有分泌功能，蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC2啟動(dòng)表達(dá)，可以將蔗糖轉(zhuǎn)化酶分泌至細(xì)胞外，使無(wú)色的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride， TTC）還原為不可溶的紅色物質(zhì)1，3，5-三苯甲臜（1，3，5-triphenylformazan），因此通過(guò)TTC顯色可以進(jìn)一步確定其信號(hào)肽的分泌功能。

1.2.5 ?目的基因表達(dá)模式分析 ?采用針刺接種法[26]，用1 mL無(wú)菌注射器將100 μL甘蔗鐮孢菌CNO-1的分生孢子懸浮液（1×106個(gè)/mL）接種至長(zhǎng)勢(shì)一致的5葉期甘蔗幼苗的生長(zhǎng)點(diǎn)附近，在接種后0、12、24、48、72、120、168、216 h的每株接種點(diǎn)下部葉鞘位置進(jìn)行取樣，將樣品置于液氮中迅速冷凍后，–80℃貯藏備用。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)包括3株不同植株、同一植株的3個(gè)葉片。樣品采集后立即液氮速凍，保存于–80℃?zhèn)溆谩＠肨aKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa）試劑盒提取總RNA，PrimeScript? RT reagent Kit（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)Fs11724基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物Fs11724-qRTF/R（表1）。以FvActin 作為內(nèi)參基因[27]，引物為FvActinF/R（表1）。應(yīng)用Roche LightCycler96系統(tǒng)，分別以各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的cDNA為模板（50 ng/μL），使用TB Green熒光染料法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物2 μL，TB Green 10 μL，超純水6 μL。PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95℃ 30 s;兩步法擴(kuò)增 95℃ 15 s，60℃ 30 s，45 cycles;融解曲線95℃ 15 s，95℃ 60 s，97℃ 1 s;降溫37℃ 30 s。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，按照2-ΔΔCT法[28]分析Fs11724基因在甘蔗鐮孢菌侵染甘蔗不同階段的相對(duì)表達(dá)量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?Fs11724基因生物信息學(xué)分析

Fs11724基因開放閱讀框（open reading frame， ORF）為822 bp，編碼273個(gè)氨基酸，其編碼蛋白分子量為28.24 kDa，理論pI值為4.29，親水性平均系數(shù)–0.072，屬于親水性蛋白。通過(guò)SignalP 4.1和SMART軟件同時(shí)預(yù)測(cè)Fs11724信號(hào)肽序列，F(xiàn)s11724編碼蛋白的273個(gè)氨基酸，前21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列（1～21 aa： MASQRLFAAF AALSIIIGSEA），預(yù)示該蛋白可能具有分泌功能（圖1）。利用軟件TMHMM Server V2.0跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，PredGPI預(yù)測(cè)無(wú)GPI錨點(diǎn)位點(diǎn)，TargetP 1.1 Server定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于信號(hào)肽導(dǎo)向的分泌途徑，推測(cè)Fs11724基因編碼蛋白為經(jīng)典分泌蛋白并分泌至細(xì)胞外發(fā)揮作用。利用NCBI CD search對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Fs11724編碼蛋白序列含有一個(gè)碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域CBM4_9（圖1）。

2.2 ?Fs11724基因的克隆

根據(jù)已經(jīng)獲得的甘蔗鐮孢菌Fs11724基因的ORF設(shè)計(jì)基因特異性引物Fs11724-PVXF/R，以實(shí)驗(yàn)室保存的F. sacchari RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到長(zhǎng)度約822 bp大小的特異條帶（圖2），克隆測(cè)序獲得的序列與基因組分析獲得的序列一致。

2.3 ?Fs11724抑制BAX在本氏煙草葉片上誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死

BAX在植物體內(nèi)誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死與病原菌誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)（hypersensitive response， HR）在生理特性上具有相似性[29]，且以BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死（programmed cell death， PCD）試驗(yàn)已被廣泛運(yùn)用于多種病原菌效應(yīng)基因的功能研究[30-32]。因此本實(shí)驗(yàn)以空載EV為陰性對(duì)照，BAX作為激發(fā)煙草葉片超敏反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)鑒定Fs11724基因毒性功能。按照?qǐng)D3B所示，將攜帶有空載EV及Fs11724基因的農(nóng)桿菌懸浮液滲透注射至本氏煙草葉片相應(yīng)位點(diǎn)，24 h后注射攜帶BAX基因的重組菌液，7 d后取樣拍照。如圖3A，單獨(dú)注射空載和Fs11724基因的位點(diǎn)沒有發(fā)生細(xì)胞壞死，而在注射EV+BAX和單獨(dú)注射BAX位點(diǎn)均觀察到細(xì)胞壞死，說(shuō)明BAX在煙草葉片中成功表達(dá)并且誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)，同時(shí)也表明空載本身對(duì)BAX誘導(dǎo)細(xì)胞壞死作用無(wú)影響。在共表達(dá)Fs11724和BAX的注射位點(diǎn)沒有出現(xiàn)壞死病斑，F(xiàn)s11724成功抑制BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死（30個(gè)重復(fù)中27個(gè)重復(fù)表現(xiàn)抑制），說(shuō)明Fs11724是一個(gè)可抑制HR反應(yīng)的效應(yīng)蛋白基因，具有潛在抑制寄主防御反應(yīng)的毒性功能。

2.4 ?Fs11724信號(hào)肽分泌功能驗(yàn)證

CMD-W培養(yǎng)基不含酵母生長(zhǎng)所需色氨酸，以蔗糖、葡萄糖為碳源。YPRAA培養(yǎng)基以棉籽糖為唯一碳源。YTK12缺失蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC2及色氨酸合成酶基因;載體pSUC2含有色氨酸合成酶基因，以及一個(gè)缺失信號(hào)肽和起始密碼子ATG的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC2。因此，缺陷型菌株YTK12在CMD-W及YPRAA上均不能生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)入pSUC2載體的酵母菌株可依賴載體本身含有的色氨酸操縱子功能在缺乏色氨酸的CMD-W平板上生長(zhǎng)。當(dāng)載體pSUC2插入具有分泌功能且含有起始密碼子ATG的信號(hào)肽片段時(shí)，SUC2基因啟動(dòng)表達(dá)，分泌蔗糖轉(zhuǎn)化酶使酵母在以棉籽糖為碳源的YPRAA培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。如圖4所示，攜帶空載體pSUC2或mg87非分泌信號(hào)肽的酵母不能在YPRAA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而含有分泌蛋白Avr1b信號(hào)肽或Fs11724信號(hào)肽的酵母轉(zhuǎn)化子在YPRAA培養(yǎng)基中可以正常生長(zhǎng)，表明Fs11724信號(hào)肽具有分泌功能。Fs11724蛋白信號(hào)肽與陽(yáng)性對(duì)照Avr1b信號(hào)肽使TTC溶液變紅色，而陰性對(duì)照Mg87信號(hào)肽不能使TTC溶液變色，說(shuō)明插入的Fs11724信號(hào)肽與Avr1b信號(hào)肽片段使蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC2啟動(dòng)表達(dá)，并將蔗糖轉(zhuǎn)化酶分泌至細(xì)胞外，使無(wú)色的TTC還原為不可溶的紅色物質(zhì)1，3，5-三苯甲臜，進(jìn)一步證明Fs11724信號(hào)肽具有分泌活性。

2.5 ?Fs11724基因表達(dá)模式分析

通過(guò)qRT-PCR對(duì)Fs11724基因在F. sacchari侵染甘蔗過(guò)程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。以Fs11724在F. sacchari菌絲體的表達(dá)量作為對(duì)照（設(shè)相對(duì)表達(dá)量為1），Excel軟件繪制表達(dá)模式圖，結(jié)果如圖5所示，F(xiàn)s11724基因在病菌侵染甘蔗過(guò)程中呈現(xiàn)2個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)峰值，第一個(gè)峰值出現(xiàn)在侵染早期，表達(dá)量從12～48 h呈現(xiàn)梯度式升高，48 h表達(dá)量達(dá)到最高，約為菌絲表達(dá)量8.1倍;72 h表達(dá)量呈斷崖式下降;第二個(gè)峰值從120 h開始，表達(dá)量顯著升高，168 h達(dá)到最高，約為菌絲表達(dá)量9.8倍，與在菌絲體的表達(dá)量存在極顯著差異。由此可見，F(xiàn)s11724基因不僅在侵染初期誘導(dǎo)表達(dá)，并且在后期真菌由寄生轉(zhuǎn)腐生階段顯著表達(dá)，推測(cè)Fs11724基因在病原侵染甘蔗早期、后期發(fā)揮作用。

3 ?討論

目前已在多種病原微生物中報(bào)道了CBM類基因，CBM家族基因眾多，在病原菌與植物互作中發(fā)揮不同的功能。GUI等[20]發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌（V. dahliae）中一個(gè)含有CBM1結(jié)構(gòu)域的基因可以在本氏煙草葉片上抑制GH12引起的細(xì)胞壞死，說(shuō)明CBM1可能與植物的免疫反應(yīng)有關(guān);BURG等[15]克隆了番茄葉霉病菌（C. fulvum）中的CBM14基因，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白可以結(jié)合真菌幾丁質(zhì)，保護(hù)真菌菌絲免受植物幾丁質(zhì)酶的降解;VOLK等[19]從黃萎病病原菌（V. nonalfalfae）中克隆到1個(gè)CBM18基因，可以干擾寄主的免疫反應(yīng)，說(shuō)明該基因在參與植物防御方面發(fā)揮重要功能。本研究在甘蔗梢腐病病原菌基因組基礎(chǔ)上，通過(guò)結(jié)構(gòu)域分析得到了一個(gè)具有CBM4_9結(jié)構(gòu)域的新基因Fs11724，通過(guò)侵染煙草發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)s11724可以在煙草葉片上抑制BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，說(shuō)明該基因可能在抑制植物免疫過(guò)程中發(fā)揮功能，推測(cè)該基因可能作為毒力因子發(fā)揮功能。但是該基因在病原菌與植物互作中，通過(guò)怎樣的方式發(fā)揮功能，發(fā)揮何種具體形式的功能，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

真菌效應(yīng)蛋白通常依賴常規(guī)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑分泌至細(xì)胞外發(fā)揮作用[33]，在這一過(guò)程中，信號(hào)肽通過(guò)引導(dǎo)新合成蛋白靶向分泌途徑以確保蛋白的胞外分泌，其功能必不可少。如大麗輪枝菌效應(yīng)基因VdEG1和VdEG3可在煙草中誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，缺失信號(hào)肽后其誘導(dǎo)壞死功能喪失，說(shuō)明其功能的發(fā)揮需要VdEG1和VdEG3的細(xì)胞外分泌[20]。本研究中，通過(guò)信號(hào)肽分泌功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Fs11724信號(hào)肽具有分泌功能，表明Fs11724編碼的蛋白是一個(gè)典型的分泌蛋白。但其信號(hào)肽的缺失是否會(huì)影響其功能的發(fā)揮，需要進(jìn)一步的探究。

之前的研究中，稻瘟菌CBM50效應(yīng)蛋白Slp1在侵染早期被快速誘導(dǎo)表達(dá)且在稻瘟菌感染水稻后的24～28 h觀察到在植物-真菌界面上積累[18];蘿卜炭疽病菌效應(yīng)蛋白ChELP1和ChELP2在侵染后40 h表達(dá)量最高，并證實(shí)在早期活體寄生階段參與幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫反應(yīng)[17]。Fs11724在侵染早期的誘導(dǎo)表達(dá)說(shuō)明該基因可能參與早期抑制寄主防御反應(yīng)過(guò)程。此外，甘蔗鐮孢菌作為一種兼性腐生菌，需經(jīng)歷從活體寄生階段到死體營(yíng)養(yǎng)階段的轉(zhuǎn)變[4]，在這個(gè)過(guò)程中，病原真菌以擴(kuò)增碳水化合物活性酶種類及數(shù)量或增強(qiáng)碳水化合物酶活性引起寄主植物死亡完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)[34]，F(xiàn)s11724基因后期誘導(dǎo)高表達(dá)，推測(cè)有可能通過(guò)增強(qiáng)碳水化合物酶活性，參與到寄轉(zhuǎn)腐階段植物碳水化合物的降解。

目前許多研究集中于參與逃避幾丁質(zhì)引發(fā)的免疫的質(zhì)外體效應(yīng)蛋白的功能特性上，尤其是真菌CBM50/LysM效應(yīng)蛋白[13]。如前所述的CBM18、CBM14等碳水化合物結(jié)合模塊效應(yīng)蛋白利用類似策略參與植物免疫調(diào)控[15， 19]，對(duì)于CBM家族中是否還有其他成員參與類似機(jī)制有待進(jìn)一步挖掘?；谝陨戏治觯現(xiàn)s11724編碼的蛋白為甘蔗鐮孢菌F. sacchari的一個(gè)效應(yīng)蛋白，其信號(hào)肽具有胞外分泌活性，F(xiàn)s11724可以在非寄主植物煙草上抑制BAX誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，并在真菌侵染植物過(guò)程中顯著表達(dá)，因此推測(cè)Fs11724可能在調(diào)控植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。但CBM4_9的分子生物學(xué)功能及Fs11724是否真能如我們推測(cè)的，通過(guò)參與真菌幾丁質(zhì)保護(hù)逃逸幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫反應(yīng)而協(xié)助病原菌侵染還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。本研究首次在甘蔗鐮孢菌中鑒定了一個(gè)含CBM4_9的效應(yīng)蛋白基因并對(duì)其功能進(jìn)行初步解析，為進(jìn)一步研究病原-甘蔗互作分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)有助于闡明甘蔗抗感梢腐病的機(jī)制，為抗病品種培育和病害防控提供參考。

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