肖小虎 林顯祖 龍翔宇 秦云霞 陽江華 方永軍

摘 ?要：為研究巴西橡膠樹鉀轉(zhuǎn)蛋白（KT/HAK/KUP）基因家族在生長發(fā)育和逆境脅迫方面的生物學(xué)功能，從橡膠樹基因組中鑒定得到31個(gè)KT/HAK/KUP基因家族成員，并從基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)分析等方面進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KT/HAK/KUP基因家族31個(gè)成員分布在3個(gè)Contig和15個(gè)染色體上，8號(hào)染色體上數(shù)目較多為8個(gè)成員，其中5個(gè)為串聯(lián)重復(fù);各成員編碼的氨基酸殘基數(shù)目在288～881個(gè)不等，蛋白分子量分布在31.82～98.96 kDa，其蛋白產(chǎn)物均定位于細(xì)胞質(zhì)膜上;內(nèi)含子數(shù)目為5～11個(gè)，進(jìn)化上分為4個(gè)明顯分支。在表達(dá)方面，部分成員呈現(xiàn)明顯的組織特異性，在葉片發(fā)育過程中成員HbKUP5、HbKUP6、HbKUP9和HbKUP14表達(dá)發(fā)生明顯變化，乙烯利刺激后HbKUP30和HbKUP31在膠乳中的表達(dá)明顯上調(diào)，在抗寒品種‘93～114’中，HbKUP5和HbKUP9在低溫處理后明顯下調(diào)表達(dá)。本研究結(jié)果為深入解析KT/HAK/KUP基因家族的功能和培育高鉀抗逆的橡膠樹品種提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹;KT/HAK/KUP;基因家族;逆境脅迫;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S794.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identifcation and Expression of KT/HAK/KUP Genes in Hevea brasliensis

XIAO Xiaohu1， LIN Xianzu1，2， LONG Xiangyu1， QIN Yunxia1， YANG Jianghua1， FANG Yongjun1*

1. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： In order to study the biological functions of KT/HAK/KUP gene family in the growth and development and stress of Hevea brasiliensis， 31 KT/HAK/KUP genes were identified， and the gene structure， chromosomal location， evolution and expression were analyzed. 31 members of KT/HAK/KUP gene family were distributed on 3 contig and 15 chromosomes. There were 8 members on chromosome 8， and 5 of which were tandem repeats. The number of amino acid residues ranged from 288 to 881， and the molecular weight of the proteins ranged from 31.82 to 98.96 kDa， the proteins were located on the cytoplasmic membrane， with 5 to 11 introns. All the mumbers could be divided into four distinct branches in evolution. The expression of HbKUP5， HbKUP6， HbKUP9 and HbKUP14 were significantly changed during leaf development. And the expression of HbKUP30 and HbKUP31 in latex were significantly up-regul?ated under ethephon stimulation. In cold resistant cultivar ‘93-114’， the expression of HbKUP5 and HbKUP9 was significantly down-regulated under low temperature treatment. The results of this study would provide theoretical guidance for further study the functions of KT/HAK/KUP gene family and high potassium stress resistant rubber tree varieties breeding.

Keywords： Hevea brasiliensis; KT/HAK/KUP; gene family; stress; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.001

在植物生長發(fā)育的過程中，鉀（K+）離子作為第二信使扮演著至關(guān)重要的角色。植物主要通過鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)對(duì)K+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，KT/ HAK/KUP（K+ uptake permease/high-affinity K+/K+ transporter）是植物體內(nèi)最大的K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族，在植物養(yǎng)分代謝、生長調(diào)控和抵御脅迫等過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。目前已經(jīng)從水稻[2]、玉米[3]、番茄[4]、楊樹[5]等植物中克隆得到多個(gè)KT/HAK/KUP基因家族成員。研究表明，KT/ HAK/KUP家族成員屬于跨膜蛋白，主要定位于細(xì)胞的膜系統(tǒng)，包含10～15個(gè)跨膜域。在擬南芥中，鉀饑餓（無K+）可以誘導(dǎo)AtHAK5的表達(dá)，在鉀離子濃度小于50 μmol/L時(shí)athak5突變體種子萌發(fā)緩慢，根生長受抑制，鉀離子吸收能力降低[6]。鉀饑餓同樣可以誘導(dǎo)水稻OsHAK5表達(dá)，將OsHAK5在煙草BY2細(xì)胞中表達(dá)，鹽脅迫條件下細(xì)胞大量積累K+而非Na+，表明OsHAK5是對(duì)鹽敏感的高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[7]。擬南芥AtKUP1-4在發(fā)育時(shí)期的莖尖、花序分生組織、葉基部等組織中表達(dá)量有不同程度的增加，推測(cè)這些基因參與擬南芥的生長發(fā)育過程[8]。另外，鹽脅迫和激素刺激均能調(diào)控KUP基因的表達(dá)，表明KUP在維持細(xì)胞K+、Na+平衡和K+信號(hào)感知方面具有重要功能[9-10]。

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料和軍事戰(zhàn)略物資，巴西橡膠樹是天然橡膠生產(chǎn)的主要來源。目前關(guān)于巴西橡膠樹KT/HAK/KUP基因家族的研究尚未見報(bào)道，這限制了我們對(duì)巴西橡膠樹鉀離子運(yùn)輸和分配的全面了解。隨著橡膠樹基因組測(cè)序的完成和不斷優(yōu)化，使我們能夠?qū)φ麄€(gè)橡膠樹KT/HAK/KUP基因家族進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。本研究從橡膠樹轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定得到31個(gè)KT/HAK/KUP基因家族成員，并從基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式等方面對(duì)這些家族成員進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。研究結(jié)果將有助于全面了解KT/HAK/KUP基因家族成員在橡膠樹鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)和分配，以及生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答調(diào)控方面的重要功能。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究不同組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所用材料為巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）‘熱研7-33-97’，除了根來自于‘熱研7-33-97’組培苗外，其他組織（包括膠乳、樹皮、葉片、種子、雌花和雄花）均來自正常割膠橡膠樹（開割兩年以上），葉片不同發(fā)育時(shí)期的材料來自于一年生的‘熱研7-33- 97’嫁接苗;乙烯利處理的材料為‘熱研7-33-97’正常開割樹（3天一刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在0、3、12、24 h等4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)涂抹橡膠樹割面。以上材料均來自海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院院區(qū)實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 ?方法

1.2.1 ?橡膠樹KT/HAK/KUP家族成員的鑒定 ?橡膠樹基因組數(shù)據(jù)（包括基因組fasta文件和gff3文件注釋文件）來自本實(shí)驗(yàn)橡膠樹基因組升級(jí)版本（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)，從NCBI下載擬南芥[11]、水稻[12]、楊樹[5]和木薯[13]的KT/ HAK/KUP蛋白序列，利用HMMER軟件構(gòu)建KT/ HAK/KUP的HMM模型，然后利用該模型對(duì)橡膠樹蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，得到橡膠樹KT/ HAK/ KUP家族成員，然后通過Pfam和CDD數(shù)據(jù)庫，對(duì)鑒定出的橡膠樹KT/HAK/KUP進(jìn)行保守域驗(yàn)證。

1.2.2 ?基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析 ?根據(jù)橡膠樹基因組GFF3文件包含的相關(guān)注釋信息對(duì)橡膠樹KT/ HAK/KUP家族成員的基因結(jié)構(gòu)和染色體定位進(jìn)行分析，利用TBtools[14]軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化作圖。利用MEGA 6.0[15]軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用Neighbor-Joining方法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，進(jìn)行1000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，利用軟件Figtree（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行調(diào)整修飾。

1.2.3 ?基因的表達(dá)模式分析 ?利用solexa轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)[16]對(duì)橡膠樹KT/HAK/KUP基因在不同組織、不同葉片發(fā)育時(shí)期和乙烯利處理下的表達(dá)進(jìn)行分析。首先對(duì)原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量序列，然后利用程序RSEM[17]進(jìn)行表達(dá)分析，最后結(jié)合進(jìn)化樹信息，利用TBtools繪制熱圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?橡膠樹KT/HAK/KUP家族成員的鑒定

本研究利用已發(fā)表的擬南芥、水稻、楊樹和木薯KT/HAK/KUP蛋白氨基酸序列構(gòu)建HMM模型，對(duì)橡膠樹蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，得到31個(gè)KT/HAK/ KUP基因家族成員同源序列。通過Pfam和CDD數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，31個(gè)成員都含有KT/ HAK/KUP蛋白的所特有的保守結(jié)構(gòu)域，命名為HbKUP1～HbKUP31（表1）。KT/HAK/KUP基因家族31個(gè)成員分布在3個(gè)Contig和15個(gè)染色體上，8號(hào)染色體上成員數(shù)目較多共8個(gè)，其中5個(gè)為串聯(lián)重復(fù);各基因成員編碼的氨基酸殘基數(shù)目在288～881個(gè)不等，蛋白分子量分布在31.82～ 98.96 kDa，大多編碼堿性蛋白，等電點(diǎn)分布在5.04～ 9.3之間，其蛋白產(chǎn)物均定位于細(xì)胞質(zhì)膜（表1）。

2.2 ?橡膠樹KT/HAK/KUP家族成員的染色體定位

從31個(gè)橡膠樹KT/HAK/KUP家族成員的染色體定位可以看出（圖1，表1），8號(hào)染色體上成員數(shù)目最多有8個(gè)成員，17號(hào)染色體上有3個(gè)成員，1、6、14和16號(hào)染色體上均有2個(gè)成員，

3、4、5、9、10、11、13、15和18號(hào)染色體，以及3個(gè)Contig上面均有1個(gè)成員（表1）。其中8號(hào)染色體上5個(gè)成員成簇分布，6、16和17號(hào)染色體上有成員成對(duì)分布，這些成員可能是進(jìn)化中通過基因復(fù)制產(chǎn)生的串聯(lián)重復(fù)，而6和16號(hào)染色體上基因的復(fù)制可能發(fā)生6和16號(hào)染色復(fù)制之前，這從兩個(gè)染色體間成員的同源性高于每個(gè)染色體上2個(gè)成員之間的同源性可以看出（藍(lán)線連接表明有較高同源性）。從圖中可以看出，串聯(lián)復(fù)制和染色體復(fù)制事件是KT/HAK/KUP家族成員擴(kuò)張的重要因素。

2.3 ?基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析

利用基因組序列及注釋文件，對(duì)橡膠樹KT/ HAK/KUP基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各家族成員內(nèi)含子數(shù)目在5～11之間，在相同進(jìn)化分支中的各成員在內(nèi)含子數(shù)目

和相對(duì)位置上更為相似，部分成員出現(xiàn)了較大內(nèi)含子，如HbKUP2、HbKUP17和HbKUP18（圖2B）;在蛋白結(jié)構(gòu)域方面，大部分家族成員都具有相似的motif，也有部分成員出現(xiàn)了motif的缺失，如HbKUP12和HbKUP19在蛋白的N端，HbKUP22的C端，以及HbKUP1、HbKUP18和HbKUP27中部有motif的缺失，這部分成員可能在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了功能分化（圖2A）。

為了比較橡膠樹和其他植物KT/HAK/KUP蛋白在進(jìn)化上的相互關(guān)系，選取了楊樹（Populus trichocarpa， Pt）、擬南芥（Arabidopsis thaliana， At）、水稻（Oryza sativa， Os）、木薯（Manihot esculenta， Me）和蓖麻（Ricicus communis， Rc），以及橡膠樹（Hevea brasiliensis， Hb）KT/HAK/KUP蛋白氨基酸序列，利用軟件MEGA 6.0采用Neighbor-Joining法，并進(jìn)行1000次bootstrap統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)構(gòu)建進(jìn)化樹（圖3）。從圖中可以看出，KT/HAK/KUP家族在進(jìn)化上分為4個(gè)大的分支Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，其中Ⅰ和Ⅱ又分為Ⅰ- a，Ⅰ-b和Ⅱ-a，Ⅱ-b。在每個(gè)分支中橡膠樹和木薯聚在一起，這和二者的親緣關(guān)系更近是一致的。在Ⅱ-b中HbKUP27和其他4個(gè)成員HbKUP28～ HbKUP31聚在一起，而這5個(gè)成員對(duì)應(yīng)的基因成簇出現(xiàn)在8號(hào)染色體上，通過串聯(lián)復(fù)制而來，其中HbKUP27在進(jìn)化過程中出現(xiàn)基因結(jié)構(gòu)缺失。從后續(xù)表達(dá)分析可以看出HbKUP27失去功能不表達(dá)，而HbKUP30和HbKUP31則主要在膠乳中起作用。

2.4 ?橡膠樹KT/HAK/KUP基因家族成員的表達(dá)分析

利用本實(shí)驗(yàn)室已有轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)31個(gè)橡膠樹KT/HAK/KUP基因在不同組織、不同葉片發(fā)育時(shí)期和乙烯利處理后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。其中不同組織包括膠乳、樹皮、葉片、根、種子、雌花和雄花。從圖4可以看出，部分家族成員功能相對(duì)比較保守，在各組織中均有表達(dá)，如HbKUP3、HbKUP8、HbKUP9、HbKUP18、HbKUP19、HbKUP20和HbKUP22（圖4）;部分成員在膠乳中表達(dá)豐度較高，如HbKUP20、HbKUP22和HbKUP30;葉片中HbKUP5和HbKUP9表達(dá)豐度相對(duì)較高，而樹皮中HbKUP5、HbKUP7、HbKUP9和HbKUP26表達(dá)豐度較高。另外，在根中HbKUP9的表達(dá)豐度也是最高的，說明HbKUP9在各組織鉀離子運(yùn)輸中具有重要作用，而在進(jìn)化過程中又進(jìn)化出組織特異性表達(dá)的新成員。

KT/HAK/KUP基因在葉片發(fā)育過程中的表達(dá)情況如圖5所示，在葉片發(fā)育過程中部分家族成員的表達(dá)發(fā)生明顯變化，如HbKUP5和HbKUP9明顯上調(diào)表達(dá)，在穩(wěn)定態(tài)葉中表達(dá)豐度達(dá)到最高;HbKUP6呈明顯下調(diào)表達(dá)，在庫葉中表達(dá)豐度較高;而HbKUP14的表達(dá)呈先上升后下降的趨勢(shì)，主要在變色期的葉中表達(dá)。以上基因的表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)葉片細(xì)胞的滲透壓，進(jìn)而影響葉片的生長發(fā)育。

為分析乙烯刺激對(duì)膠乳中基因表達(dá)的影響，進(jìn)行了乙烯利刺激實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在乙烯刺激前后，HbKUP20、HbKUP22和HbKUP30的表達(dá)豐度都相對(duì)較高，這和前面不同組織表達(dá)分析結(jié)果一致。HbKUP22、HbKUP30和HbKUP31受乙烯刺激影響，上調(diào)表達(dá)，HbKUP30和HbKUP31上升趨勢(shì)最為明顯（圖6）。從前面基因的染色體定位分析可以看出，HbKUP30和HbKUP31是在8號(hào)染色體，通過串聯(lián)復(fù)制進(jìn)化而來，這2個(gè)基因可能是在橡膠樹進(jìn)化過程中產(chǎn)生的用來調(diào)控乳管滲透壓的特異表達(dá)基因。在割膠過程中，乳管細(xì)胞將失去大量細(xì)胞質(zhì)，需要補(bǔ)充大量水分和碳源，滲透壓的調(diào)節(jié)顯得尤為重要。另外，鉀在植

物中還參與多種酶的活化，具有重要的生物學(xué)功能。由以上結(jié)果可以推測(cè)HbKUP30和HbKUP31在橡膠樹乳管膠乳再生過程中具有重要作用。

低溫寒害是制約我國橡膠種植面積的重要因素，已有文獻(xiàn)表明KT/HAK/KUP在植物抗逆方面具有重要功能。因而本研究對(duì)KT/HAK/KUP基因在低溫脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，HbKUP5和HbKUP9在葉片中表達(dá)相對(duì)較高，和前面基因在不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果一致，但HbKUP5和HbKUP9在低溫敏感品種‘熱墾501’與抗寒品種‘93-114’葉片中的表達(dá)存在明顯不同，在4℃低溫處理1 h后HbKUP5和HbKUP9在‘熱墾501’中表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而在‘93-114’中表達(dá)呈明顯的下降趨勢(shì)（圖7），這可能和2種材料對(duì)低溫的響應(yīng)機(jī)制不同有關(guān)。由以上結(jié)果可以推測(cè)，HbKUP5和HbKUP9的表達(dá)和橡膠樹的抗寒具有一定的相關(guān)性。

3 ?討論

天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料和軍事戰(zhàn)略

物質(zhì)，巴西橡膠樹是天然橡膠的主要來源。天然橡膠樹的生成需要消耗大量的原料，鉀作為植物生長所必需的三大主要元素之一，在調(diào)控植物生長發(fā)育和參與植物逆境脅迫應(yīng)答等方面具有重要作用，鉀離子對(duì)于橡膠樹膠乳的再生也必然具有重要作用。本研究從橡膠樹基因組中鑒定出31個(gè)KT/HAK/KUP家族基因，在進(jìn)化上主要分為4個(gè)大的分支，從水稻[12]、楊樹[5]、木薯[13]等不同植物的研究可以看出，KT/HAK/KUP家族成員的數(shù)目在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了較大幅度的擴(kuò)增，主要通過染色片段復(fù)制和基因的串聯(lián)復(fù)制實(shí)現(xiàn)。但通過分析可以發(fā)現(xiàn)，其他植物的串聯(lián)重復(fù)大多是2～3個(gè)成員的串聯(lián)重復(fù)[18-19]，而在橡膠樹中卻出現(xiàn)了多達(dá)5個(gè)成員的串聯(lián)重復(fù)。從基因的表達(dá)還可以看出，這5個(gè)串聯(lián)重復(fù)成員中僅2個(gè)成員HbKUP30和HbKUP31主要在膠乳中表達(dá)，其他成員在各組織中均不表達(dá)或表達(dá)量很低，在乙烯利處理后HbKUP30和HbKUP31的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯的上升趨勢(shì)，這和乙烯處理后膠乳產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)一致。從橡膠樹的進(jìn)化來看，橡膠樹乳管是在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的一種特化組織，乳管中合成了大量的次生代謝產(chǎn)物天然橡膠烴，而這個(gè)過程需要大量的原料補(bǔ)充，這其中也包括鉀離子，因而橡膠樹在進(jìn)化過程中進(jìn)化出了適應(yīng)這一功能的基因HbKUP30和HbKUP31，進(jìn)而保障了乳管中天然橡膠生物合成的順利進(jìn)行。本研究從基因家族成員的鑒定、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式等方面對(duì)橡膠樹KT/HAK/KUP各家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，從中篩選出橡膠樹乳管和葉片等組織中主要表達(dá)的成員。研究結(jié)果為深入研究KT/HAK/KUP基因家族的功能和培育高鉀抗逆的橡膠樹品種提供了理論基礎(chǔ)。

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