多效唑影響朱頂紅植株生長的轉(zhuǎn)錄組分析
2022-02-10 23:34黃寶華許小瓊陳曉慧徐小萍張春渝林玉玲賴鐘雄
熱帶作物學(xué)報(bào) 2022年1期
關(guān)鍵詞：生長
黃寶華 許小瓊 陳曉慧 徐小萍 張春渝 林玉玲 賴鐘雄
摘 ?要：朱頂紅具有較高觀賞價(jià)值，但其高花莖和葉太長成為其發(fā)展盆栽的限制因素。本研究應(yīng)用不同濃度的多效唑（paclobutrazol， PBZ）對(duì)朱頂紅進(jìn)行處理，觀測其表型性狀的特征，并應(yīng)用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本分析。結(jié)果表明，PBZ對(duì)朱頂紅的株高及葉片長度具有抑制作用，隨著PBZ濃度的增加，其株高越矮，葉長逐漸變短，各處理間呈顯著差異，成熟的花莖高度也隨PBZ濃度的增加而降低。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析，Q20介于98.320%～98.450%之間，均值為98.385%，說明測序質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)分析。差異基因富集最顯著的途徑為苯并噁唑嗪酮類化合物生物合成途徑。對(duì)差異表達(dá)基因的GO功能分類進(jìn)行分析，在生物過程分類下的6個(gè)比對(duì)中，差異表達(dá)基因富集到的前3個(gè)詞條分別是：代謝過程、細(xì)胞過程、單一生物過程。在細(xì)胞組成的6個(gè)比對(duì)中，差異表達(dá)基因富集到的前7個(gè)詞條都是一致的，分別是細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜、細(xì)胞器、膜部分、細(xì)胞器部分、大分子復(fù)合物，其富集相似度很高。在分子功能的6個(gè)比對(duì)中，前3個(gè)的富集詞條分別是催化活性、綁定、運(yùn)輸活動(dòng)。表明不同濃度PBZ主要通過影響植物體內(nèi)各種生物學(xué)過程來調(diào)控朱頂紅矮化，同時(shí)也涉及改變植物組織細(xì)胞組分以及調(diào)控分子功能來影響朱頂紅矮化。KEGG功能分類中，代謝占比最大，都達(dá)60%以上。Pathway富集分析也顯示差異基因顯著富集在代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成中。通過對(duì)代謝通路進(jìn)行分析，表明影響脂肪酸的合成及丙二酰COA的提升是矮化的影響因素之一。木質(zhì)素的大量合成和微管蛋白TUBA、TUBB的提升促使莖粗的增加。茉莉酸甲酯和不飽和脂肪酸類的提升和合成促使其抗性的提升。HSF、hsp70及HSP90基因表達(dá)的提升，提高了其耐熱性。研究結(jié)果為進(jìn)一步了解PBZ對(duì)朱頂紅的影響機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，也為朱頂紅育種提供了參考。
關(guān)鍵詞：朱頂紅;多效唑;RNA-seq;生長
中圖分類號(hào)：S682.2.5 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
Transcriptome Analysis of the Effect of Paclobutrazol on the Growth of Hippeastrum
HUANG Baohua1， XU Xiaoqiong2， CHEN Xiaohui2， XU Xiaoping2， ZHANG Chunyu2， LIN Yuling2，
LAI Zhongxiong2*
1. Zhangzhou Institute of Technology， Zhangzhou， Fujian 363000， China; 2. Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract： Hippeastrum has high ornamental value， but its long flower stem and leaf are the limiting factors for its potted development. In this study， different concentrations of paclobutrazol （PBZ） were used to treat Hippeastrum for observing the characteristics of its phenotypic traits， and using RNA-seq technology for transcript analysis. PBZ could inhibit the plant height and leaf length of Hippeastrum. With the increase of PBZ concentration， the plant height and the leaf length became shorter， and there were significant differences among different treatments. The mature flower stem height also decreased with the increase of PBZ concentration. After transcriptome analysis， Q20 ranged from 98.320% to 98.450%， and the average percentage was 98.385%， indicating that the sequencing quality was good and could be used for subsequent analysis. The most significant pathway of differential gene enrichment was the biosynthesis pathway of benzoxazozinone compounds. GO functional classification of differentially expressed genes was analyzed. Among the six comparisons under biological process classification， the first three terms enriched by differentially expressed genes were metabolic process， cellular process and single biological process. Among the six comparisons of cell composition， the first seven terms enriched by differentially expressed genes were all the same， namely cell， cell part， membrane， organelle， membrane part， organelle part and macromolecular complex， with high similarity in enrichment. Among the six comparisons of molecular functions， the first three enrichment terms were catalytic activity， binding and transport activity respectively. The results indicated that different concentrations of PBZ mainly regulated the dwarfism mechanism of Hippeastrum through affecting various biological processes in plants， and also involve changing plant tissue cell components and regulating molecular functions to affect Hippeastrum dwarfism. In the functional classification of KEGG， metabolism accounts for the largest proportion， reaching more than 60%. Pathway enrichment analysis also showed that differential genes were significantly enriched in metabolic pathways and biosynthesis of secondary metabolites. The metabolic pathway analysis indicated that the influence of fatty acid synthesis and the promotion of malonyl COA was one of the factors affecting the dwarfing. The massive synthesis of lignin and the increase of tubulin TUBA and TUBB promoted the increase of stem thickness. The enhancement and synthesis of methyl jasmonate and unsaturated fatty acids promoted the enhancement of its resistance. The increase of HSF， hsp70 and HSP90 gene expression improved its heat resistance. The experimental results would lay a foundation for further understanding the effect mechanism of PBZ on Hippeastrum， and also provide a reference for Hippeastrum breeding.
Keywords： Hippeastrum; paclobutrazole; RNA-seq; growth
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.01.023
朱頂紅（Hippeastrum）是多年生草本球根花卉[1]，在花卉產(chǎn)業(yè)中具有很大的商業(yè)價(jià)值?？筛鶕?jù)其不同用途分為切花、盆花、景觀植物等三類。近年來，隨著朱頂紅產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，盆栽朱頂紅越來越受到人們的青睞。但在朱頂紅盆栽過程中，其高莖和葉長成為其發(fā)展的限制因素。一方面高莖和葉長易折斷，影響其商品價(jià)值;另一方面，增加了其運(yùn)輸難度及成本。為減少其運(yùn)輸體積及提高商品價(jià)值，對(duì)朱頂紅進(jìn)行矮化是較為有效的一種方式。而應(yīng)用植物生長調(diào)節(jié)劑（plant growth regulators， PGRs）是矮化植株的重要手段，多效唑（paclobutrazol， PBZ）是PGRs其中一種，在園藝作物及農(nóng)作物中已得到了廣泛使用[2-11]。多項(xiàng)研究表明，PBZ較為顯著的作用之一就是矮化植株，同時(shí)也可促使植物葉片發(fā)生形態(tài)及生理方面的變化，如葉面積減少[12-13]，葉綠素含量增加，提高其抗非生物脅迫能力及抗氧化水平[14-16]。目前對(duì)朱頂紅矮化方面的研究還相對(duì)較少，沈健等[17]及呂文濤等[18]的研究表明，PBZ對(duì)朱頂紅有較好的矮化效果，但對(duì)朱頂紅矮化分子基礎(chǔ)的了解相對(duì)較少。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-Seq）是最近發(fā)展起來的一種新型轉(zhuǎn)錄組研究手段，它以高通量和定量的方式對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行較為快速、精確、靈敏的調(diào)查[19]，因其無參考基因組的限制，為沒有基因組序列的non-model生物提供了一個(gè)較為全面有效的方式來分析轉(zhuǎn)錄組。本研究以盆栽朱頂紅為材料，對(duì)經(jīng)過PBZ處理和未經(jīng)處理的朱頂紅葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析朱頂紅矮化的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集將為朱頂紅新基因的發(fā)現(xiàn)、基因組學(xué)和功能基因組學(xué)提供有價(jià)值的資源。此外，研究矮化的分子機(jī)制對(duì)朱頂紅基因育種改變植株類型具有重要意義。
1 ?材料與方法
1.1 ?材料與處理
將盆栽朱頂紅（Hippeastrum）植株（4片葉，株高15 cm左右）于1月放入溫室中（20～25℃）生長20 d后，應(yīng)用不同濃度PBZ對(duì)其進(jìn)行7 d 2次的灌根處理，清水處理為對(duì)照，處理組分別設(shè)置濃度處理為0.1、0.2、0.3 g/L，編號(hào)分別為PBZ1、PBZ2、PBZ3，每組處理20株，每株100 mL，對(duì)其進(jìn)行控水促使其快速長出新葉，抽出花葶，全部植株都抽出花葶穩(wěn)定生長時(shí)進(jìn)行表型性狀的觀測。每處理取3株生長較為一致的植株葉片進(jìn)行混樣，取完快速用液氮處理，-80℃保存?zhèn)溆?。提取RNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。試驗(yàn)共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。
1.2 ?RNA分離和文庫的構(gòu)建
采用天根生化科技（北京）有限公司的RNA植物純化試劑盒提取樣品總RNA，使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Nano Kit）檢測total RNA的濃度、RIN值、28S/18S和片斷大小，純度使用紫外分光光度計(jì)NanoDropTM進(jìn)行測定。質(zhì)量合格的總RNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集純化mRNA，在高溫條件下使用二價(jià)陽離子于NEBNext第1鏈合成反應(yīng)緩沖液（5×）中使其片斷化，以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA，然后配置二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、cDNA的3￠末端加上堿基“A”并連接接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增;構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢，合格后進(jìn)行測序。
1.3 ?差異表達(dá)基因及其功能分類和富集分析
本項(xiàng)目使用基于泊松分布原理的PossionDis方法進(jìn)行差異基因的檢測。參照參數(shù)為Fold Change≥2和FDR（false discovery rate）≤0.01來篩選差異基因。對(duì)差異檢驗(yàn)的Q-value作多重的假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過控制FDR來決定Q-value的域值[20]。在獲得差異檢驗(yàn)的FDR值時(shí)，根據(jù)FPKM值計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)。FDR值越小，差異倍數(shù)越大，則表明差異越顯著。
根據(jù)GO（gene ontology）注釋結(jié)果及官方分類，將差異基因進(jìn)行功能分類，同時(shí)基于GOseq R軟件中的phyper函數(shù)進(jìn)行富集分析。KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）途徑中的差異表達(dá)基因的富集分析應(yīng)用R軟件，基于NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、大型蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫、NCBI非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫、KEGG同源基因數(shù)據(jù)庫、手動(dòng)注釋和鑒定蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、基因功能分類數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫注釋基因功能。
1.4 ?部分差異表達(dá)基因在不同PBZ濃度處理下的特異性表達(dá)
為進(jìn)一步了解代謝途徑中重要差異表達(dá)基因在不同PBZ濃度處理下的特異性表達(dá)，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提取HIDH（CL7862.Contig1_All）、7-IOMT（CL5344.Contig3_All）、EPHX2（Unig?e-ne1460_All）、HSPA1s（CL10622.Contig2_ All）、FAB2（CL12018.Contig4_All）、FATA（Unig-ene56852_All）、PA04（CL9035.Contig5_All）在對(duì)照組及不同PBZ濃度處理下的FPKM值，分析其表達(dá)情況，并且利用TBtools繪制熱圖。
1.5 ?表型測定方法
用直尺測定朱頂紅的植株高度，游標(biāo)卡尺測量朱頂紅葉片的長度、寬度和鱗莖粗，并觀測其生長狀態(tài)和花期等指標(biāo)。植株高度測其盆面到苗頂最高位置，葉片測量從里向外數(shù)第2個(gè)葉片的葉長和葉寬（葉片最寬處），每處理重復(fù)6株，取平均值。
2 ?結(jié)果與分析
2.1 ?表型性狀特征
不同濃度PBZ處理朱頂紅后，對(duì)其進(jìn)行性狀觀測（表1）。隨著PBZ濃度的增加，其株高越矮，葉長逐漸變短，各處理間呈顯著差異，成熟的花莖高度也隨PBZ濃度的增加而降低。而葉寬及莖粗逐漸增加，各處理間葉寬呈顯著差異，莖粗無顯著差異。表明PBZ對(duì)朱頂紅的株高及葉長抑制效果顯著，而且對(duì)朱頂紅的花期也有一定影響。經(jīng)群體觀測發(fā)現(xiàn)，PBZ處理使朱頂紅推遲開花，花期延后。
2.2 ?朱頂紅PBZ處理前后的轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量評(píng)估及差異表達(dá)基因分析
測序包括對(duì)照組（CK）、處理組（PBZ1、PBZ2、PBZ3）共4個(gè)樣品。各樣品數(shù)據(jù)過濾后的reads占總reads數(shù)的比例介于79.020%～83.930%之間，均值為81.990%;Q20介于98.320%～98.450%之間，均值為98.385%，說明測序質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)分析。其中，無論是從過濾后的reads的比例還是Q20的數(shù)值來看，均為PBZ3>PBZ2> PBZ1，說明PBZ3的測序質(zhì)量優(yōu)于PBZ2與PBZ1。
測序結(jié)果中，在CK vs PBZ1中檢測到最多數(shù)量的差異表達(dá)基因（differential expressed genes， DEGs），其中差異上調(diào)表達(dá)基因766條，差異下調(diào)表達(dá)基因6542條;PBZ1 vs PBZ2中的差異表達(dá)基因最少，其中差異上調(diào)表達(dá)基因1802條，差異下調(diào)表達(dá)基因975條。此外，本次差異基因富集最顯著的途徑為苯并噁唑嗪酮類化合物生物合成途徑。
2.3 ?朱頂紅PBZ處理前后的基因表達(dá)量分析
根據(jù)各處理的基因表達(dá)量信息，為了較為直觀地展示每個(gè)處理樣品在FPKM區(qū)間的基因數(shù)目，分別對(duì)FPKM≤1、1
對(duì)樣品間的差異表達(dá)基因進(jìn)行層次聚類分析（圖2）。圖中紅色愈深表明其上調(diào)倍數(shù)越大，藍(lán)色愈藍(lán)表明下調(diào)倍數(shù)越大。各PBZ處理與對(duì)照之間、各PBZ處理之間的比較呈兩大類。其中處理PBZ1與對(duì)照比較下降倍數(shù)較大，而處理PBZ1與PBZ2、PBZ3比較其上調(diào)倍數(shù)較大。
2.5 ?差異表達(dá)基因的GO功能分類
根據(jù)差異基因的檢測結(jié)果，為了更好地分析差異基因的生物學(xué)功能及其參與的代謝通路，對(duì)其進(jìn)行了GO功能分類（表2）。GO分為三大類：生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。表2展示了這三大分類下的最主要的一些詞條，CK與其他處理之間的差異表達(dá)基因的數(shù)量不同，但富集到的主要詞條基本一致。在生物過程分類下的6個(gè)比對(duì)中，差異表達(dá)基因富集到的前3個(gè)詞條分別是：代謝過程、細(xì)胞過程、單一生物過程。CK vs PBZ1、CK vs PBZ2、CK vs PBZ3、PBZ1 vs PBZ2第4位詞條為定位，PBZ1 vs PBZ3、PBZ2 vs PBZ3的第4位詞條為生物調(diào)節(jié)。在細(xì)胞組成的6個(gè)比對(duì)中，差異表達(dá)基因富集到的前7個(gè)詞條都是一致的，分別是細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜、細(xì)胞器、膜部分、細(xì)胞器部分、大分子復(fù)合物，其富集相似度很高。在分子功能的6個(gè)比對(duì)中，前3個(gè)的富集詞條分別是催化活性、綁定、運(yùn)輸活動(dòng)。這說明，不同濃度PBZ主要通過影響植物體內(nèi)各種生物學(xué)過程來調(diào)控朱頂紅矮化，同時(shí)也涉及改變植物組織細(xì)胞組分以及調(diào)控分子功能來影響朱頂紅矮化，因此通過GO功能分類出來的富集途徑解釋朱頂紅矮化機(jī)理的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有較為積極的意義。
2.6 ?差異表達(dá)基因的KEGG生物通路分類及富集分析
2.6.1 ?KEGG功能分類 ?根據(jù)差異表達(dá)基因參與的KEGG代謝通路主要將其分為5個(gè)分支，分別為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝及有機(jī)系統(tǒng)。共有差異表達(dá)Unigene數(shù)目為22 468個(gè)。其中CK vs PBZ1的差異Unigene數(shù)目為5497，占24.47%;CK vs PBZ2的差異Unigene數(shù)目為3804，占16.93%;CK vs PBZ3的差異Unigene數(shù)目為2890，占12.86%;PBZ1 vs PBZ2的差異Unigene數(shù)目為2269，占10.10%;PBZ1 vs PBZ3的差異Unigene數(shù)目為4995，占22.23%;PBZ2 vs PBZ3的差異Unigene數(shù)目為3013，占13.41%（表3）。6個(gè)對(duì)比中5個(gè)分支的類別一致，其中細(xì)胞過程僅含運(yùn)輸和分解代謝，環(huán)境信息處理包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜運(yùn)輸，遺傳信息處理包括翻譯、轉(zhuǎn)錄、折疊分類降解、復(fù)制和修復(fù)，代謝則包含全局和總覽圖、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、核苷酸代謝、萜類和多酮類化合物的代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸的代謝、多糖的生物合成和代謝，有機(jī)系統(tǒng)僅包含環(huán)境適應(yīng)。6個(gè)比對(duì)中，細(xì)胞過程的占比分別為是5.08%、5.57%、3.98%、4.85%、4.76%、5.18%，環(huán)境信息處理的占比分別為是6.19%、7.75%、7.09%、5.95%、5.33%、6.77%，遺傳信息處理的占比分別為是19.28%、19.98%、17.44%、17.58%、16.64%、16.43%，代謝的占比分別為是64.13%、62.01%、66.12%、67.30%、69.25%、67.61%，有機(jī)系統(tǒng)的占比分別為是5.33%、4.68%、5.36%、2.56%、4.02%、4.02%?？梢姡?個(gè)比對(duì)中，各分類所占比例大致相同，代謝占比最大，均達(dá)60%以上，而代謝中前2位的為全局和總覽圖、碳水化合物代謝，這表明PBZ處理影響了朱頂紅的代謝，進(jìn)而影響了其生長發(fā)育，進(jìn)而有了矮化的表型性狀特征。
2.6.2 ?差異基因的Pathway富集分析 ?通過對(duì)差異基因所參與的途徑進(jìn)行分析，有助于了解朱頂紅矮化機(jī)制所涉及的途徑，從而進(jìn)一步了解PBZ調(diào)控朱頂紅矮化的分子機(jī)理。圖3所示是對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG分類中Q-value較小的前20個(gè)通路。從圖3中可看出，基于富集因子，在CK vs PBZ1比對(duì)中顯著富集的前5個(gè)途徑為苯并噁嗪類生物合成、酮體的合成與降解、氮素代謝、黃酮和黃酮生物合成、玉米素的生物合成（圖3A）;CK vs PBZ2顯著富集的前5個(gè)途徑有糖鞘脂生物合成-神經(jīng)節(jié)系列、糖胺聚糖降解、二苯乙烯，二芳基庚烷和姜酚的生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、鞘脂類代謝（圖3B）;CK vs PBZ3顯著富集的前5途徑有苯并噁嗪類生物合成、光合作用-觸角蛋白、單萜生物合成、光合作用、檸檬烯和蒎烯降解（圖3C）;PBZ1 vs PBZ2顯著富集的前5個(gè)途徑有苯并噁嗪類生物合成、異黃酮的生物合成、光合作用、單萜生物合成、倍半萜和三萜生物合成（圖3D）;PBZ1 vs PBZ3顯著富集的前5個(gè)途徑有光合作用、光合作用-觸角蛋白、黃酮和黃酮生物合成、氮素代謝、檸檬烯和蒎烯降解（圖3E）;PBZ2 vs PBZ3顯著富集的前5個(gè)途徑有光合作用-觸角蛋白、光合作用、氮素代謝、核黃素代謝、泛醌和其他萜類醌的生物合成（圖3F）。在CK vs PBZ1、CK vs PBZ2、CK vs PBZ3、PBZ1 vs PBZ2、PBZ1 vs PBZ3和PBZ2 vs PBZ3各組對(duì)比中，差異基因數(shù)目最多的是代謝途徑，其次為次生代謝產(chǎn)物的生物合成，且都顯著富集到了這2個(gè)途徑。總之，苯并噁嗪類生物合成途徑明顯參與響應(yīng)PBZ處理。
2.6.3 ?代謝通路的分析 ?圖4是6個(gè)對(duì)比中幾個(gè)代謝的大致變化，紅色代表代謝增強(qiáng)，綠色代表代謝減弱?？煽闯?，6個(gè)對(duì)比的代謝變化大致相同。其中核苷酸代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成等代謝途徑都增強(qiáng)，其中嘌呤、嘧啶、β-丙氨酸、咖啡因、核黃素、硫胺素、維生素B6、卟啉和葉綠素、葉酸、苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、吲哚生物堿生物合成、異喹啉生物堿生物合成、泛酸和CoA生物合成、泛醌和其他萜類醌生物合成等呈上升趨勢。聚糖的生物合成和代謝途徑、脂類代謝、萜類和聚酮化合物的代謝減弱，其中糖鞘脂生物合成-乳酸和新乳酸系列、糖鞘脂生物合成-球狀體、糖基轉(zhuǎn)移酶、N-聚糖生物合成、其他聚糖降解、蛋白聚糖、亞油酸代謝、糖胺聚糖生物合成硫酸角蛋白、α-亞麻酸代謝、類胡蘿卜素生物合成、單萜、倍半萜類和三萜類生物合成、玉米素生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、脂肪酸生物合成和降解、鞘脂類代謝、甘油酯類代謝、甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂類生物合成蛋白質(zhì)等呈下降趨勢。在脂肪酸生物代謝途徑中，丙二酰輔酶A、十六碳烯酸、十八碳烯酸上調(diào)，其他脂肪酸都受到抑制，可能是朱頂紅經(jīng)過PBZ處理后，抑制了大部分脂肪酸的合成和降解，而一些特殊的脂肪酸合成增加。α-亞麻酸途徑中，最終產(chǎn)物是茉莉酸甲酯增加。異黃酮途徑中，大量合成葡萄糖苷-丙二酸，剛好下一步形成丙二酰COA。在苯丙烷生物合成途徑中，促進(jìn)木質(zhì)素的合成。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工代謝中，與耐熱相關(guān)的基因HSF、hsp70、HSP90都上調(diào)，表明可提高其耐熱性。
2.7 ?部分差異表達(dá)基因在不同PBZ濃度處理下的特異性表達(dá)
基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挑選7個(gè)與代謝途徑顯著相關(guān)的差異表達(dá)基因，即HIDH、7-IOMT、EPHX2、HSPA1s、FAB2、FATA、PA04，結(jié)合其FPKM值通過TBtools在線軟件進(jìn)行聚類熱圖分析。結(jié)果（圖5）表明，與對(duì)照組相比，大多數(shù)差異表達(dá)基因（HIDH、FATA、PAO4、7-IOMT、EPHX2及FAB2）在PBZ2濃度處理下表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，其中HIDH、7-IOMT以及FAB2為顯著下調(diào)。在PBZ1濃度處理下，F(xiàn)ATA和PAO4表達(dá)下調(diào)，7-IOMT和HSPA1s則為表達(dá)上調(diào)。在PBZ3濃度處理下，HIDH、FATA及PAO4表達(dá)顯著上調(diào)，HSPA1s及EPHX2則為下調(diào)表達(dá)，其中HSPA1s表達(dá)顯著下調(diào)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究朱頂紅矮化機(jī)制提供了借鑒。
3 ?討論
朱頂紅經(jīng)不同濃度的PBZ處理后，植株變矮，葉長變短，葉寬變寬，莖粗增加。與沈健等[17]及呂文濤等[18]的研究結(jié)果一致，都認(rèn)為PBZ對(duì)朱頂紅的矮化效果顯著。不同濃度的矮壯素（CCC）對(duì)朱頂紅的矮化效應(yīng)則不盡相同，300 mg/L的CCC對(duì)朱頂紅的葉長有一定抑制作用，其他濃度抑制效果不明顯，表明不同植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)朱頂紅生長特征的影響不同。多效唑（paclobutrazol， PBZ）是一種較為高效的生長延緩劑，主要作用是阻礙赤霉素的生物合成[21-22]，加速體內(nèi)生長素的分解，從而延緩、抑制植株的營養(yǎng)生長，還具有抑制莖桿伸長，縮短節(jié)間、促進(jìn)植物分蘗、增加植物抗逆性能，提高產(chǎn)量等效果。除應(yīng)用于果樹的矮化栽培外，曾廣泛用于防止連晚秧苗徒長，大豆、大麥和小麥等農(nóng)作物的降矮抗倒。對(duì)經(jīng)PBZ處理后的朱頂紅進(jìn)行形態(tài)特征觀察后，認(rèn)為與多效唑的作用基本吻合。
本研究首次采用RNA-seq技術(shù)對(duì)PBZ處理后的朱頂紅基因表達(dá)譜進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)主要集中在代謝途徑及次生代謝產(chǎn)物的生物合成中。根據(jù)該結(jié)果，試圖全面了解PBZ對(duì)朱頂紅生長發(fā)育的影響，并進(jìn)一步研究朱頂紅矮化的分子機(jī)制，為朱頂紅的分子育種研究提供一定的理論基礎(chǔ)。將重點(diǎn)放在4個(gè)濃度處理后基因表達(dá)的對(duì)比上，其中核苷酸代謝、輔助因子和維生素的代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成這些代謝途徑增強(qiáng)，聚糖的生物合成和代謝途徑、脂類代謝、萜類和聚酮化合物的代謝減弱。β-酮脂酰-ACP還原酶、β-酮脂酰-ACP合成酶的降低，使催化從乙酰CoA及丙二酰CoA合成長鏈脂肪酸的反應(yīng)降低，從而使整個(gè)脂肪酸的合成降低，而脂肪酸合成的降低會(huì)導(dǎo)致肥胖、生長發(fā)育遲緩等問題。而1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）的矮化作用也是在催化乙酰CoA羧化成丙二酰CoA時(shí)降低，PBZ和ACC的作用類似。丙二酰輔酶A的增加則是由于異黃酮途徑中大量合成的葡萄糖苷-丙二酸促使丙二酰輔酶A的形成。在動(dòng)物上，丙二酰COA會(huì)導(dǎo)致肥胖[23]。苯丙烷類生物合成中促進(jìn)了木質(zhì)類的合成。在花生四烯酸代謝中，20-羥二十烷四稀酸（20-HETE）下降，四氫呋喃二元醇顯著升高，四氫呋喃型也屬于木質(zhì)素類，木質(zhì)素類也顯著提高。吞噬體中，2個(gè)關(guān)鍵基因TUBA、TUBB上調(diào)，TUBA和TUBB以非共價(jià)鍵的形式連接形成異二聚體，異二聚體首尾相連則形成微管蛋白原纖維，這在一定程度上可以解釋PBZ處理促使木質(zhì)素類的合成及微管蛋白的提升，使莖粗增加。通過對(duì)銀杏基因組的研究發(fā)現(xiàn)，古樹主要通過持續(xù)合成木質(zhì)素等物質(zhì)，增加樹干的密度和強(qiáng)度，以支撐不斷增粗的樹體。十六碳烯酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸在代謝途徑中大量合成，這些物質(zhì)都屬于ω-3脂肪酸（omega-3 fatty acids）的家族成員，又稱n-3脂肪酸，是一類不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸具有提高抗性、抗衰老、抗氧化的功能。亞麻酸代謝途徑中，茉莉酸甲酯顯著提升，在其他途徑中還形成了3，6-壬二烯醛、9-醛基壬酸、乙烯醚類脂肪酸等不飽和脂肪酸類?？梢?，PBZ的作用機(jī)制是通過提高茉莉酸甲酯和不飽和脂肪酸類的合成，從而提高免疫力。趙曼如等[24]認(rèn)為茉莉酸甲酯作為植物激素和信號(hào)分子，外用則可激發(fā)植物防御基因的表達(dá)，提高其抗逆性。徐建祥等[25]也認(rèn)為茉莉酸甲酯具有誘導(dǎo)和激活植物體內(nèi)自身免疫系統(tǒng)來抵御外來蟲害侵害的功能。王文霞等[26]也認(rèn)為不飽和脂肪酸及其衍生物在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要的生理功能。值得特別指出的是，顯著富集的苯并噁嗪類生物合成途徑，代謝產(chǎn)物是丁布，對(duì)于提高植物抗性具有重要意義。
在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工代謝中，基因HSF、hsp70及HSP90都上調(diào)，hsf是耐熱轉(zhuǎn)錄因子，hsp70和HSP90是熱脅迫的時(shí)候，與hsf形成復(fù)合體，啟動(dòng)耐熱反應(yīng)，所以PBZ處理后可以提高耐熱性。研究發(fā)現(xiàn)，耐熱番茄Hsf24基因在提高番茄耐熱性上有著尤為重要的作用[27]。在動(dòng)物上，李秋玲等[28]也認(rèn)為HSF1基因microRNA SNPs可作為奶?？篃釕?yīng)激的候選分子標(biāo)記應(yīng)用于育種實(shí)踐。
細(xì)胞數(shù)量的多少和大小控制著葉片的大小，而細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨脹則控制著細(xì)胞的數(shù)量和大小，參與這些過程的基因表達(dá)變化與葉片的變化和植株矮化相關(guān)?；蚪y(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，很多有關(guān)細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨脹的相關(guān)基因在PBZ處理下都呈現(xiàn)出較為明顯的變化。
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