朱忠勝，殷諾，張東，肖海軍，薛鋒

(上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院骨科，上海 201406)

多年來，臨床上治療大段骨缺損缺少理想的方法。而納米生物材料、3D打印生物材料、基因治療、外泌體組織工程等新型骨組織工程學的快速發(fā)展為大段骨缺損治療帶來了新的希望[1-4]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一組鋅與鈣離子依賴性的肽鏈內(nèi)切酶家族，在干細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移行為過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[5-8]，但其在干細胞成骨分化中的作用尚不明確。本課題組前期研究結(jié)果提示肌源性間充質(zhì)干細胞具有良好的成骨分化能力和促進骨修復的作用[9]，同時發(fā)現(xiàn)MMP-2在肌肉異位骨化中高表達，在肌源性間充質(zhì)干細胞抗凋亡實驗中發(fā)現(xiàn)了MMP-2存在顯著的表達變化，并且抑制MMP-2表達后肌源性間充質(zhì)干細胞的細胞活力明顯降低，提示MMP-2在肌源性間充質(zhì)干細胞成骨及骨修復過程中可能具有重要的調(diào)控作用。本研究采用大鼠肌肉原代分離出的肌源性間質(zhì)干細胞，通過構(gòu)建MMP-2過表達及干擾載體，觀察MMP-2對肌源性間充質(zhì)干細胞成骨分化及鈣結(jié)節(jié)形成的影響。

1 資料與方法

1.1 材料 I型膠原酶(YEASEN)，胰蛋白酶(北京中杉金橋)，青-鏈霉素(杭州吉諾)，Dulbecco氏培養(yǎng)基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)/F12培養(yǎng)液(GIBICO)，胎牛血清(GIBICO)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(北京天根)，多聚賴氨酸(碧云天)，CD44/90/29/105抗體(Abcam)，CD106/45抗體(Abcam)，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)抗體(Abcam)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)抗體(Santacruz)，骨鈣素(osteocalcin，OCN)抗體(Abcam)，β-actin抗體(Abcam公司)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(TAKARA)，RNA提取試劑Trizol(Ambion)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)，質(zhì)粒DNA提取試劑盒(北京天根)，限制性內(nèi)切酶(Thermo Fisher)，茜素紅染色試劑盒(Sigma)，成骨誘導液(Thermo Fisher)。流式細胞儀(BD)，倒置顯微鏡(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 肌源性間充質(zhì)干細胞的原代分離培養(yǎng)及鑒定 (1)取4周雄性SD大鼠脫頸處死；(2)消毒后切取右后肢股四頭肌約2 g，剪成肉糜狀；(3)PBS液沖洗3次去除上清；加入2～3倍體積0.10% Ⅰ型膠原酶，置入37℃水浴消化40 min(其間吹打數(shù)次)；(4)離心，吸除上清，加入2～3倍體積的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA)，37℃水浴消化20 min(其間吹打數(shù)次)；(5)加入含20%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)液2～3 mL終止消化，同上法離心5 min；(6)吸除上清，加入含20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，所得細胞懸液用100、200、400目濾網(wǎng)依次過濾，將濾液置入未經(jīng)多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)瓶中，使之貼壁；(7)1 h后將未貼壁的細胞轉(zhuǎn)入新的經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。4 d后首次換液，以后2～3 d換液1次；(8)待細胞生長達70%融合后，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1︰2比例進行傳代；(9)取傳達2代后培養(yǎng)的細胞進行流式檢測：CD90(+)、CD105(+)、CD44(-)、CD45(-)，檢測確定后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MMP-2過表達及干擾載體的構(gòu)建 (1)過表達載體Plvx-IRES-ZsGreen1-MMP-2的構(gòu)建：根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中MMP-2 (NM_031054.2)序列信息設(shè)計并合成PCR引物，上游為AATTCCTCGAGACTAGTTATGGAGGCACGATTGGTCTG，下游為ATCCGCGGCCGCTCTAGTCAGCAGCCCAGCCAGTC。以含目的基因MMP-2的cDNA為模板，進行PCR擴增MMP-2基因，再以目的基因PCR產(chǎn)物和Plvx-IRES-ZsGreen1載體進行酶切及回收，并進行質(zhì)粒驗證；(2)干擾質(zhì)粒Plvx-shRNA2-sh-MMP-2的構(gòu)建：設(shè)計并合成引物，合成單鏈 DNA oligo，把片段1、片段2干粉溶解于退火緩沖液中(100 μL)，90℃，5 min，然后自然冷卻至室溫，使其復性成雙鏈。Plvx-shRNA2載體BamHI和EcoRI雙酶切及回收、連接轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提，最后測序鑒定。

1.2.3 免疫蛋白印跡(western blot，WB) 檢測上調(diào)和下調(diào)MMP-2表達后肌源性間充質(zhì)干細胞成骨分化標志蛋白(RUNX2、OCN、ALP)表達的影響。分別于第1天、第7天、第14天收集肌源性間充質(zhì)干細胞，加入細胞裂解液，12 000 rpm，4℃離心5 min，提取上清液。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入一抗RUNX2、OCN、ALP (1︰1 000)雜交。以β-actin為內(nèi)參。

1.2.4 茜素紅染色 (1)收集經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對數(shù)生長期的肌源性間充質(zhì)干細胞，用胰酶消化1～2 min，在倒置顯微鏡下觀察消化后細胞的形態(tài)變化，當有少量細胞懸浮時棄掉消化液，加入2～4 mL培養(yǎng)液終止消化，吹打分散細胞；(2)用血球計數(shù)板計數(shù)，24孔板加入爬片，每孔2×104個細胞，設(shè)3個重復，根據(jù)實驗需要培養(yǎng)加入成骨誘導液第7天、第14天時進行染色；(3)在每個時間點先輕輕棄除培養(yǎng)液，PBS沖洗3次。加入95%酒精固定30 min；(4)將茜素紅染液用0.22 μm濾紙過濾，加入染液覆蓋住底孔，室溫染色放置5 min；(5)PBS漂洗3次。風干，甘油明膠封片；(6)顯微鏡觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料組間比較采用獨立t檢驗或者方差分析，計數(shù)資料組間比較用Fisher確切概率法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肌源性間充質(zhì)干細胞原代分離培養(yǎng)及鑒定 肌源性間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察：取原代培養(yǎng)的細胞接種于培養(yǎng)皿后，分別于培養(yǎng)0 d、1 d、7 d鏡下觀察，鏡下可見大量大小不一的圓形細胞懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)1d后開始有細胞貼壁生長，呈多邊形、梭形，分散在培養(yǎng)皿貼壁生長；培養(yǎng)7 d后細胞排列較整齊，融合成片生長，形態(tài)一致，呈長梭形，融合率達70%(見圖1)。肌源性間充質(zhì)干細胞表面標記物檢測：流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，第3代大鼠肌源性間充質(zhì)干細胞表面標記物CD90、CD105陽性率均高于90%，而CD44、CD45陽性率均低于1%，這提示我們所分離得到的細胞即為具有干細胞特征的大鼠肌源性間充質(zhì)干細胞(見圖2)。

圖1 培養(yǎng)0 d、1 d、7 d后肌源性間充質(zhì)干細胞的形態(tài)特征(×100)

圖2 肌源性間充質(zhì)干細胞原代分離培養(yǎng)的流式細胞鑒定

2.2 MMP-2過表達及干擾載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染成功的肌源性間充質(zhì)干細胞 根據(jù)MMP-2的全長序列，設(shè)計3條相應(yīng)的shRNA序列及相應(yīng)的對照序列，分別為sh-MMP-2-1、sh-MMP-2-2和sh-MMP-2-3。WB實驗檢測結(jié)果提示sh-MMP-2-2對于MMP-2的表達干擾作用最好(見圖3a)，被選作為后續(xù)實驗中干擾MMP-2的shRNA序列；同時相較于對照組，MMP-2的過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后結(jié)果提示MMP-2的表達明顯上調(diào)，這對于后續(xù)研究MMP-2影響肌源性干細胞成骨分化及相關(guān)蛋白表達奠定了基礎(chǔ)(見圖3b)。

a sh-MMP-2明顯下調(diào)細胞中MMP-2的表達水平 b 過表達質(zhì)粒明顯上調(diào)MMP-2的表達

2.3 MMP-2促進肌源性間充質(zhì)干細胞的成骨基因的表達 WB檢測各時相肌源性間充質(zhì)干細胞中成骨因子表達水平：轉(zhuǎn)染shRNA或者MMP-2的過表達質(zhì)粒，干預(yù)肌源性間充質(zhì)干細胞中MMP-2的表達后，繼續(xù)培養(yǎng)細胞，分別在第1天、第7天、第14天采用WB檢測細胞中成骨基因RUNX2、OCN、ALP的表達水平。結(jié)果與陰性對照組相比較，干擾MMP-2的表達后在第1天、第7天、第14天，RUNX2、OCN、ALP的表達明顯下調(diào)(P值分別為0.037、0.038、0.033，均<0.05)，而過表達MMP-2后RUNX2、OCN、ALP的表達隨之明顯上調(diào)(P值分別為0.02、0.03、0.01，均<0.05)，這提示MMP-2可能通過促進成骨分化相關(guān)蛋白RUNX2、OCN、ALP的表達促進肌源性間充質(zhì)干細胞的成骨過程，具體分子機制有待進一步闡明(見圖4)。

a 培養(yǎng)1 d b 培養(yǎng)7 d c 培養(yǎng)14 d

2.4 MMP-2促進肌源性間充質(zhì)干細胞鈣結(jié)節(jié)的形成 對肌源性間充質(zhì)干細胞分別轉(zhuǎn)染MMP-2過表達質(zhì)?；騭hRNA后，于第7天和第14天進行茜素紅染色，結(jié)果顯示對照組、過表達組、干擾組細胞在培養(yǎng)第7天時組間茜素紅染色差異不大(P>0.05)；但是，在培養(yǎng)14 d時過表達組的茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)最多，干擾組最少，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖5)。

圖5 茜素紅染色檢測鈣結(jié)節(jié)形成情況(茜素紅染色，×100)

3 討 論

3.1 肌源性間充質(zhì)干細胞的作用 肌源性間充質(zhì)干細胞具有一般干細胞的特點，可以自我更新、繁殖產(chǎn)生更多的干細胞，同時也可以分化成各種各樣的具有特定功能的細胞，既可以向成肌細胞方向分化，也可向成骨細胞方向分化[10]。肌源性間充質(zhì)干細胞作為組織工程的種子細胞，來源廣，易獲取，既沒有胚胎干細胞的倫理問題，也沒有骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-mesenchymal stem cells，BM-MSCs)的來源受限問題，因為成年人肌肉組織約占體重的35%～45%[11-12]。眾多的研究表明，肌源性干細胞能夠分化成軟骨和骨，可以直接參與骨折愈合。肌源性干細胞在與骨膜損傷更嚴重的骨折中的作用尤為重要[13-16]。研究指出肌源性間充質(zhì)干細胞不僅能直接參與骨組織的修復，同樣也可以通過BM-MSCs類似的作用促使旁分泌因子的分泌影響骨修復[17]。

3.2 MMP的作用 MMP是一組鋅與鈣離子依賴性的肽鏈內(nèi)切酶家族。家族所有成員具有一些共同的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域，通過其某個區(qū)的增減修飾而形成不同的MMP。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和作用底物不同可分為6大類：膠原酶、明膠酶、溶基質(zhì)素、溶間質(zhì)素、膜型MMP和其他MMPs[5]。它們的生物學功能主要是降解細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)。在多種組織和細胞中均有表達，腫瘤細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞、骨骼肌細胞、神經(jīng)細胞、成纖維細胞等都表達不同類別的MMPs。在許多正常的生理過程，如胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、再生與組織愈合，它們都發(fā)揮著重要的功能[6-7]。它們也參與許多病理過程，如關(guān)節(jié)炎、癌癥以及心血管疾病等[18-20]。

已有研究報道多種MMPs在人BM-MSCs中表達，干細胞MMPs的表達變化影響干細胞微環(huán)境，在干細胞遷移和多種分化行為過程中起著重要調(diào)節(jié)作用[21]。BM-MSCs向成骨分化過程中表達包括MMP-2、細胞膜型1-MMP(membrane type 1 metalloprotease，MT1-MMP)在內(nèi)的多種MMPs。Schneider等[22]證明臍帶來源的間充質(zhì)干細胞在分化為成骨細胞的過程中表達MMP-1和MMP-2，這些MMPs在骨代謝和骨形成過程中可能起重要作用。

3.3 MMP-2促進成骨的作用及意義 本實驗采用原代培養(yǎng)方法分離出肌源性間充質(zhì)干細胞，通過構(gòu)建MMP-2過表達和干擾載體，上調(diào)和下調(diào)肌源性間充質(zhì)干細胞中的MMP-2表達，進而檢測肌源性間充質(zhì)干細胞成骨相關(guān)基因的表達變化及其對成骨分化的影響。研究發(fā)現(xiàn)MMP-2能夠促進肌源性間充質(zhì)干細胞的成骨分化，同時能夠促進鈣結(jié)節(jié)的形成，從一定程度上提示MMP-2在干細胞成骨分化中可能發(fā)揮重要作用。骨骼肌來源的細胞應(yīng)用于骨和軟骨組織修復和再生的研究已經(jīng)取得了長足的進展，由于骨骼肌獲得方便及實用性，將有助于骨折及大段骨缺損修復的臨床研究[23]，但其具體分子調(diào)控機制有待進一步研究。伴隨著骨組織工程技術(shù)的不斷成熟，可能為其廣泛的臨床應(yīng)用提供一定的理論支撐。