呂鑫，肖穎，李熒，龐鈺鑫，劉思靜，趙婉妤，楊飛，裴曉方，許欣

（四川大學 華西公共衛(wèi)生學院/華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041）

當今社會經(jīng)濟快速發(fā)展，人們生活水平得到了極大提高，富含膽堿、磷脂酰膽堿和左旋肉堿的食物（紅肉、家禽、魚及蛋類等）已成為日常食材。但攝入過量，會促進心腦血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的發(fā)生，進而影響人們的生活質(zhì)量。有研究預測，到2030年，全球死于心血管疾病的人數(shù)將達到2 330萬，心血管疾病將繼續(xù)占據(jù)全球死亡原因的榜首[1-2]。其中動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）被認為是CVD發(fā)病的重要病理基礎[3]。眾多研究結(jié)果表明，氧化應激貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的整個過程當中[4]，有研究證實高膽堿飲食會對AS病理過程中的氧化應激水平產(chǎn)生上調(diào)作用[5]，但目前關于高膽堿飲食對健康影響的研究尚淺，值得進一步探究。

作為我國西南地區(qū)日常茶飲——苦丁茶，學名粗壯女貞，資源豐富，價格低廉?？喽〔枋且环N富含多糖、多酚、黃酮、苯乙醇苷和生物堿等成分的天然植物，已有研究證實黃酮可通過抑制TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信號通路顯著改善高脂飲食誘導的肝脂肪變性和肝細胞損傷；酚類化合物的存在與茶籽油的抗氧化能力密切相關[6-9]。并且已有人群實驗和動物實驗表明苦丁茶能夠有效地控制CVD的相關指標，具有促進心血管健康的功效[10]?？喽〔璧目寡趸⒔怠案哐?、高血糖、高血壓”、減肥、保肝等作用，可能也有利于改善高膽堿飲食小鼠的健康問題[11]。

故本研究將對苦丁茶活性成分進行定性研究，再以高膽堿飲食C57BL/6J小鼠為實驗對象，觀察高膽堿飲食對小鼠體重、肝臟、腎臟以及氧化應激的影響，并探究不同劑量苦丁茶水提物對其改善作用，為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支撐，奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品

苦丁茶：青山綠水茶葉專業(yè)合作社（中國四川筠連）。

1.1.2 實驗動物

C57BL/6J小鼠（雌性，8 周齡，體重 19 g～22 g，SPF級）：成都達碩生物科技有限公司 [許可證號：SCXK（川）2015-030]。

屏障級動物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20℃～25℃，相對濕度40%～70%，每天照明12 h，由四川大學華西公共衛(wèi)生學院實驗動物中心提供[使用許可證號：SYXK（川）2018-011]。

1.1.3 動物飼料

基礎飼料（按照實驗動物需求，配合飼料營養(yǎng)成分GB14924.3—2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》）、高膽堿飼料（基礎飼料中加入1.3%膽堿）：成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.4 實驗試劑與儀器

甲酸、乙腈（色譜純）：德國CNW科技公司；小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶聯(lián)免疫吸附法ELISA試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；全自動生化儀檢測試劑：貝克曼庫爾特生物實驗有限公司。

高分辨質(zhì)譜儀（Xevo G2-XS QTof）、高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC）、色譜柱（ACQUITY UPLC BEH C18，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）：美國沃特世有限公司；全自動生化分析儀（AU480）：美國貝克曼庫爾特有限公司；全波長酶標儀（multiskan GO 1510）、低溫高速離心機（Sorvall Stratos）：美國賽默飛世爾科技公司；組織勻漿機（Fastprep-24）：美國 MP Biomedicals公司；光學顯微鏡（Eclipse Ci-L）：日本尼康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦丁茶樣品制備

將苦丁茶研磨并用其10倍質(zhì)量的超純水在80℃下水浴提取1 h。將殘余物再次水浴提取2次，過濾上清液。合并3次所得溶液的上清液，在60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至1 g/mL。將苦丁茶水提物在115℃下滅菌15 min，在-20℃避光保存[12]。每日灌胃苦丁茶水提物現(xiàn)配現(xiàn)用，取適量1 g/mL苦丁茶水提物37℃水浴溶解，加入超純水，稀釋至35、70、140 mg/mL 3個濃度，裝至1.5 mL無菌避光離心管中待用。

1.2.2 超高效液相色譜-飛行時間-質(zhì)譜聯(lián)用技術定性測定

吸取200 μL苦丁茶水提物，0.22 μm的有機相針孔過濾后，直接進行超高效液相色譜-飛行時間-質(zhì)譜分析。色譜條件：柱溫45℃；流動相：A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈（含 0.1%甲酸）；流速 0.4 mL/min；進樣體積2 μL；梯度洗脫：16 min。質(zhì)譜條件為離子源：電噴霧，120℃，+3/-2 kV；信號采集：正負離子掃描模式，m/z范圍為50～1 000。UNIFI 1.8.1.軟件采集原始數(shù)據(jù)，Progenesis QI v2.3軟件處理數(shù)據(jù)，人類代謝組學數(shù)據(jù)庫（the human metabolome database，HMDB） 和 Lipidmaps（v2.3）以及代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行定性。

1.2.3 動物分組與處理

25只C57BL/6J小鼠適應喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組，每組5只，分別為空白對照組、模型對照組、苦丁茶低、中、高劑量組，按1 mL/kg bw灌胃，劑量設置見表1，連續(xù)灌胃4個月后處死。

表1 實驗動物分組與處理情況（n=5）Table 1 Grouping and treatment of experimental animals（n=5）

1.2.4 標本采集及檢驗方法

1.2.4.1 小鼠一般情況觀察

每天觀察記錄各組小鼠進食量、活動、毛色與精神狀態(tài)及糞便情況。每周稱重，記錄體重變化，以樣本采集前一天體重為終體重，計算各組小鼠在灌胃結(jié)束后的體重增量。

1.2.4.2 小鼠臟器相關檢查

各組小鼠禁食不禁水12 h后，開始正式采集。處死小鼠后，分離小鼠內(nèi)臟，盡量剝離周圍結(jié)締組織和脂肪組織，稱重記錄。根據(jù)樣本采集當天記錄的小鼠終體重以及其對應的肝臟、脾臟和腎臟的重量，分別計算各組小鼠的臟器指數(shù)（肝指數(shù)、脾指數(shù)、腎指數(shù)），公式如下。

臟器指數(shù)/%=臟器重量（g）/小鼠體重（g）×100

1.2.4.3 組織切片病理學檢查

處死小鼠后，分離小鼠內(nèi)臟，盡量剝離周圍結(jié)締組織和脂肪組織，4%多聚甲醛固定肝臟、腎臟24 h，蒸餾水洗滌，酒精脫水后，石蠟包埋切片，蘇木精伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法染色后，在光學顯微鏡下200倍放大倍數(shù)觀察并拍攝各組小鼠組織病理學改變。

1.2.4.4 肝、腎功能相關指標檢測

小鼠經(jīng)眼眶取血于1.5 mL離心管中，室溫（21℃～25℃）下靜置 30 min，3 000 r/min離心 30 min，取上層血清，于-80℃保存。采用全自動生化分析儀檢測小鼠血尿素（blood urea，BU）、血肌酐（serumcreatinine，Scr）的水平；以及小鼠血清中總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、谷草輔酶（aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）以及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）的水平。

1.2.4.5 小鼠肝臟氧化應激相關指標檢測

取凍存-80℃小鼠肝臟組織標本（25 mg～30 mg），稱重記錄，置于勻漿管，加入500 μL磷酸鹽緩沖液，勻漿機徹底打碎混勻，3 000 r/min離心10 min～15 min，取上層清液待測。將小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的ELISA試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫（21℃～25℃）下平衡1 h，按照說明測定小鼠肝臟組織勻漿中兩指標的吸光值，并計算小鼠肝組織中兩種指標水平。

1.3 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，以平均數(shù)±標準差表示，組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較處理，多組間兩兩比較時，方差齊采用最小顯著性差異法，若方差不齊，采用Dunnett’s T3法，以α＝0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦丁茶活性成分

苦丁茶中含有的活性成分有四大類，各類中相對含量排列前五的代表性成分如表2所示，分別為黃酮類（1-5）、酚類（6-10）、三萜類（11-15）、生物堿（16-20）。

表2 苦丁茶中20種主要的活性成分超高效液相色譜-飛行時間-質(zhì)譜定性結(jié)果Table 2 Identification of the main representative compounds in Kuding Cha by ultra performance liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry

續(xù)表2 苦丁茶中20種主要的活性成分超高效液相色譜-飛行時間-質(zhì)譜定性結(jié)果Continue table 2 Identification of the main representative compounds in Kuding Cha by ultra performance liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry

由表2可見，苦丁茶水提物中含有豐富的黃酮類成分，且香蜂草苷含量最高，F(xiàn)eng等[8]發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化和保肝作用，主要通過抑制TLR4/NF-κB和PI3K/Akt信號通路顯著改善高脂飲食誘導的肝脂肪變性和肝細胞損傷，該成分可能與苦丁茶改善高膽堿飲食小鼠肝臟損傷作用相關。Wang等[9]從自由基清除活性、氧自由基吸收能力、蛋白羰基吸收和蛋白氫過氧化物研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物的存在與茶籽油的抗氧化能力密切相關，苦丁茶水提物中同樣含有豐富的酚類成分，可能與苦丁茶對氧化應激水平的調(diào)控相關。此外苦丁茶水提物還含有三萜類和生物堿成分，一定程度上參與苦丁茶對高膽堿飲食小鼠健康問題的改善。

2.2 各組小鼠體重變化情況

喂養(yǎng)期間，各組小鼠攝食、飲水、糞便、生長發(fā)育情況與精神狀態(tài)良好，反應靈敏，皮毛有光澤，未見行為改變或中毒表現(xiàn)，而體重呈現(xiàn)不同的變化趨勢如圖1所示。

圖1 各組小鼠體重變化情況（n=5）Fig.1 Changes of body weight of mice in each group（n=5）

圖1A顯示各組小鼠的體重均呈增長趨勢，其中模型對照組小鼠體重增量最大，高達（21.84±2.77）%。圖1B顯示模型對照組小鼠體重增量極顯著高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；各劑量組小鼠體重增量極顯著低于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且各劑量組小鼠體重增量隨劑量增加而減小，即呈負相關；高劑量組小鼠體重增量顯著低于低劑量組（P＜0.05），提示高膽堿飲食將引起體重異常增長，苦丁茶水提物可減緩由于高膽堿飲食引起的體重增長。

2.3 各組小鼠臟器指數(shù)情況

各組小鼠臟器指數(shù)計算結(jié)果見表3。

表3 各劑量組小鼠臟器系數(shù)（n=5）Table 3 Organ coefficient of mice in each dose group（n=5）

如表3所示，各組小鼠間的肝指數(shù)、脾指數(shù)和腎指數(shù)均無統(tǒng)計學差異，提示本研究中高膽堿飲食和苦丁茶水提物對肝、脾、腎無明顯影響。

2.4 肝、腎組織切片病理學檢查

當肝臟出現(xiàn)損傷時，可在染色切片中觀察到肝細胞明顯水腫壞死、變性，細胞核碎裂溶解，膽管及纖維組織增生及炎癥細胞浸潤等現(xiàn)象；當腎組織損傷時，可在染色切片中觀察到明顯的腎小管上皮細胞腫脹，腎小管擴張及粒細胞、淋巴細胞浸潤等現(xiàn)象[13]。各組小鼠的肝、腎組織切片檢查結(jié)果如圖2所示。

圖2 肝、腎組織切片病理學檢查結(jié)果（×200）Fig.2 Results of pathological examination of liver and kidney tissue sections（×200）

小鼠的肝組織切片HE染色結(jié)果顯示：各組均有部分肝細胞細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)微小空泡，但細胞核完整，細胞輪廓較清晰；模型對照組肝細胞部分變性，胞體腫脹，胞質(zhì)疏松淡染。小鼠的腎組織切片HE染色結(jié)果顯示：空白對照組、苦丁茶低劑量組、苦丁茶中劑量組的腎小球毛細血管較清晰，腎小管排列緊密，上皮細胞形態(tài)正常；模型對照組和苦丁茶高劑量組小鼠腎組織局部可見腎小管上皮細胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染。該結(jié)果提示，高膽堿飲食且沒有任何干預措施下，小鼠的肝、腎組織可能會受到輕微的影響，而高膽堿飲食并給予高劑量苦丁茶干預也有可能對小鼠的腎組織產(chǎn)生一定影響，但暫時并未發(fā)現(xiàn)苦丁茶會對小鼠產(chǎn)生明顯的肝、腎組織損傷。

2.5 肝、腎功能檢測結(jié)果

肝臟是機體內(nèi)重要的代謝器官，當其受到損傷或產(chǎn)生病變時，代謝功能也將受到干擾，引起血液中某些化學成分水平變化，因此可以通過檢測血液中這些指標的變化來反映肝臟功能[14]。肝臟是血漿ALB的主要合成場所，ALB和TP水平的降低可能表明肝臟合成蛋白質(zhì)功能障礙；肝臟中含有豐富的酶類，如負責氨基酸合成與代謝分解的ALT和AST，當肝細胞損傷或細胞膜通透性增高時，這些酶會滲入血液，使血液中ALT和AST水平增加；血清中的ALP和GGT主要來源于肝臟，兩者的血清水平變化一般保持平行，其水平升高是臨床上肝膽類疾病的標志[15-16]。血清中的小分子代謝產(chǎn)物BU和Scr通過腎小球的濾過作用被排泄到尿中，當腎臟發(fā)生病變并影響腎小球功能時，BU和Scr在血清中滯留且含量增高，因而可作為評價腎臟功能的指標[17]。各組小鼠肝、腎功能的檢測結(jié)果見表4。

表4 不同劑量的苦丁茶水提物對小鼠肝、腎功能的影響（n=5）Table 4 Effects of different doses of aqueous extract of Kuding Cha water extract on liver and kidney function in mice（n=5）mmol/L

與模型對照組相比，高劑量組的血清TP水平較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與空白對照組相比，模型對照組的ALP水平較高，高劑量組的Scr水平較低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其余指標差異均無統(tǒng)計學意義。但與模型對照組相比苦丁茶水提物干預后各組小鼠血清TP水平均出現(xiàn)不同程度的上升趨勢，BU水平均出現(xiàn)不同程度的下降趨勢。Scr本身是一種代謝廢物，正常情況下在血液中的水平較低，有研究表明Scr偏低可能和生成量減少有關，而在臨床上這種現(xiàn)象最常見于營養(yǎng)不良、極度瘦弱以及骨骼肌含量低等癥狀[18]，且高劑量苦丁茶水提物干預后，小鼠體重的增長量下降最多，為（11.39±3.86）%，提示高劑量的苦丁茶灌胃可能會對小鼠體重的正常增長產(chǎn)生影響，甚至導致其營養(yǎng)不良。

2.6 小鼠肝臟氧化應激指標結(jié)果

氧化應激是指生物體內(nèi)ROS過多的生成，降低機體抗氧化物質(zhì)如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶的活性，最終和機體抗氧化系統(tǒng)失衡而產(chǎn)生的一種應激狀態(tài)[19]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生的一種短鏈醛，也是機體評價機體氧化應激程度的標志物之一，SOD則是機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成，其活力水平可反映機體清除自由基的能力[20]。各組小鼠肝臟氧化應激相關指標結(jié)果如表5所示。

表5 苦丁茶水提物對小鼠氧化應激相關指標的影響（n=5）Table 5 Effects of aqueous extract of Kuding Cha on oxidative stress in mice（n=5）

與空白對照組相比，模型對照組的MDA含量較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），許多研究表明，高膽堿飲食可引起小鼠機體產(chǎn)生氧化應激損傷，Ren等[21]發(fā)現(xiàn)給予昆明小鼠3%膽堿含量的飲用水可以導致氧化反應標志物MDA水平的升高以及抗氧化物質(zhì)SOD和谷胱甘肽過氧化物酶活力的降低，本實驗與Li等[22]的研究結(jié)果一致。與模型對照組相比，各劑量組的MDA含量均下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中，苦丁茶中劑量組的MDA含量最低，為（0.285±0.032）nmol/mg；與模型對照組相比，各劑量組的SOD活力均上升，其中，苦丁茶中劑量組的SOD活力顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），該結(jié)果說明，中劑量苦丁茶水提物對小鼠體內(nèi)氧化應激反應的調(diào)控效果較好。

3 結(jié)論

高膽堿飲食會引起實驗小鼠體重異常增長，可能對其肝、腎組織造成一定影響，并增加小鼠肝組織中的MDA含量、降低SOD活性；苦丁茶水提物可降低小鼠體重增長幅度，其中，苦丁茶高劑量組的體重增長量最低且伴有Scr下降及血清TP上升，提示高劑量苦丁茶水提物可能會引起小鼠營養(yǎng)不良，但各組肝、腎組織切片觀察尚未出現(xiàn)明顯病理學損傷，尚不能說明對肝腎組織造成損傷；苦丁茶水提物均能降低小鼠MDA水平，中劑量苦丁茶水提物干預還可增強小鼠SOD活力，該結(jié)果表明高膽堿飲食小鼠體內(nèi)氧化應激水平增加，抗氧化能力減弱，苦丁茶水提物的干預可以降低小鼠體內(nèi)的氧化損傷并增強抗氧化酶的活力，從而減輕氧化應激程度，改善高膽堿飲食的健康問題。